STK15基因RNA干扰真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞侵袭的影响.pdfVIP

· 1385 · 中阂药物与临床2013年 11月第 l3卷第 11期ChineseRem — — edies !! ! !! !：!!：! 著 · STK15基因RNA干扰真核表达载体的构建 及对人结肠癌细胞侵袭的影响 李晓钟 王晓霞 贺杰峰 裴 毅 【摘 要 】 目的 构建STKI5基因特异的RNA干扰 (RNAi)真核表达质粒 ，将其转染人结肠癌细胞 SW480后．观察对 STK15基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞侵袭能力的影响。方法 设计并合成能表达小发夹 结构 RNA (shRNA)的DNA序列，退火后与载体pGPU6／GFP／Neo连接，构建重组表达载体 pGPU6／GFP／Neo． STK15shRNA，转化DH5c~菌株后挑选阳性克隆，提取质粒进行序列测定。脂质体介导重组质粒转染人结肠癌 SW480细胞 ，于转染后24h和48h通过反转录一聚合酶链反应 (RT．PCR)和蛋白印迹法分别在 mRNA和蛋白水 平检测STK15基因的表达，并通过细胞体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭能力。结果 测序证实插入pGPU6／ GFPN／eo载体的DNA序列 、方向和位点均正确。与阴性质粒转染组比较，pGPU6G／FPN／eo．STKI5shRNA质粒转 染细胞24h和48h后，STK15基因的mRNA和蛋白表达水平均明显降低，且呈现时间依赖性，STK15mRNA水 平分别下调 80％和 98％．蛋 白水平分别下调40％和80％。与阴性质粒转染组比较 ，pGPU6／GFP／Neo—STK15 shRNA质粒转染细胞的侵袭能力分别下降约67％和89％。结论 成功构建了针对STK15基因的特异性shRNA 真核表达载体，转染细胞后可抑制STKI5基因的表达和细胞的侵袭能力，为进一步研究 STK15基因功能以及探 讨结肠癌治疗的新途径奠定了基础。 【关键词】 RNA干扰；结肠肿瘤；真核表达载体；STK15 ConstructionandeffectsofSTK15eukaryoticexpression vectorforRNA interferenceon invasionofhuman coloncancerceHs LIXiao—zhong*,WANGXioo—xia,HEm-feng,PEiYi．DepartmentofEmergency,Shanxi Provincia1 o口lesHospital,Taiyuan030o12．China IAbstract】0bjective ToconstructtheSTK15eukaryoticexpressionvectorforRNA interferenceandinvesti． gateitsinhibitoryeffectonSTK15geneexpressionandinvasionofhumancoloncancerSW480cellsfollowingtrans— fection．Me~ods TheoligonucleotidesequencesencodingshorthairpinRNA (shRNA1weredesignedandsyntlle— sized． which wereannealed and cloned intovectorpGPU6／GFP，Neo ofrconstruction ofpGPU6／GFP，Neo．STK15 shRNA。 therecombinantplasmid，whichwassubsequentlytransformedintothecellstrainDH5 forselectio