Decorin基因过表达对HEK 293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达的影响.pdfVIP

中日友好医院学报2012年第26卷第6期 Jomol c n 却 mFrienhipHospito1，2012Dec，Vo1．26，，v0．6 343 Decorin基因过表达对HEK293T细胞微管 相关蛋白LC3和 自噬基因beclinl表达的影响 赵婷婷 ，古艳婷 ，李 平 ，朱 斌 ，董 唏 ，张浩军 (1．中 日友好医院临床医学研究所 药物药理室，北京 100029；2．北京协和医学院，北京 100730) 摘要 目的：构建人核心蛋 白聚糖 (DCN)重组质粒 ，研究其对微管相关蛋 白LC3和 自噬基 因beelinl表达 的影 响。方法：从人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)提取总 RNA，经 RT—PCR获得 decorin的全长 cDNA，克隆至T一载 体 pUM—T并测序 ，亚克隆至真核表达载体 pcDNA3．1V／5一His．再次测序正确后 以磷酸钙共沉淀法瞬时转染 HEK293T细胞 ．利用 RT—PCR、WesternBlot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋 白LC3和 自噬基 因beclinl转录水平及翻译水平 的表达 。结果：经 DNA测序证实人 DCNcDNA片段正确插入真核表达载体中。 WesternBlot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中 目的基因高表达 。RT—PCR和 WesternBlot 结果显示 ，与空载体组相 比，重组质粒转染组 LC3转录水平显著降低 ，beclinl和 LC3一II的翻译水平均显著降 低 。结论 ：成功构建人 DCN重组质粒 ，其在 HEK293T中过表达可以显著降低微管相关蛋 白LC3和 自噬基 因 beclinl表达 ，为进一步研究DCN与 自噬的相互作用奠定了基础 。 关 键 词：核心蛋 白聚糖；自噬；微管相关蛋 白轻链 3：beclinl 中图分类号 ：R34 文献标识码 ：A 文章编号 ：1001—0025(2012)06—0343—05 doi：10．3969／j．issn．1001—0025．2012．06．008 overexpressiOn ofhuman decorin influencing LC3 and beclinl expression in HEK 293T eells／／ZHAO Ting-ring，GU Yan-ting，LIPing，etal／／JournalofChina-Japan Friendship Hospital，2012Dec，26(6)： 343-347 Abstract Objective：Toinvestigatetheeffectsofdeeorinon regulatingtheautophagyofHEK 293Tcells． Methods：HEK 293T cellswere transiently transfected with recombinantplasmid decorin by calcium phos— phate．After72h，the expression ofhuman decorin inHEK 293T cellswasdetectedbyWestern Blot．Then，the effectsofdecorinontheexpressionofautophagyrelatedgene(includingLC3andbeclin1)wereanalyzedby RT—PCR and Western blot．Results：The recombinant plasmid DNA decorin was successfully constructed．The fusion protein can express in HEK 293T cel1．Compared with controlvector group，the mRNA expression of LC3wassignificantlydown-regulatedinthegroupofoverexpressionofdecorin(PO．05)，meanwhile，themRNA levelofbeclinlshowednosignificantdifferencebe