HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定.pdfVIP

浙江中医药大学学报2012年 l1月第36卷第n期 HIF一1基因慢病毒载体的构建和鉴定 王标 ’余勤’周丽萍 ’付珊2朱振洪 单威 刘伟 ，胡韶君 1．浙江中医药大学生物工程学院 杭州 310053 2．浙江大学医学院附属第一医院 摘要：f目的】构建带有大鼠HIFlet基因的慢病毒表达载体，并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染。(方法】从pEGFP—N1-HIF一10【载体中扩增出 HIF—let基因片段，将 目的基因与pLenti6．3-MCS-RES2-EGFP载体连接 ，获得慢病毒表达载体pLend6．3一HIF一1oL—IR．ES2一EGFP，并用磷酸钙转染 法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装，48h后收集上清液并过滤，按不同感染复数感染293T细胞，通过观察报告基因绿色 荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率。 构建了共表达HIF一1理基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenfi6．3一HIF—let—I1~$2一EGFP， 经PCR及测序结果证实，并对其成功包装出慢病毒，病毒滴度为4x10吁ur／nl。[结论】成功构建出HIF—loL基因重组慢病毒载体pLenti6．3一HIF—let— IRES2一EGFP并能有效的包装出慢病毒。 关键词：HIF—let；慢病毒载体；293T细胞 中圈分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1005—5509(2012)11—1221-04 ConstructionandIdentificationofHIF-laGeneRecombinantLenfivirusVectorWangBiao，YuQin,ZhouLiping,etalInstituteofBiologicalEn— gineering,ZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou(310053,~China；2．TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalSchoolofZhejiangUniversity Abstract：fObjective]ToconstructlentiviralVectorwhichencodesfulllengthratHIF一1geneandpackagethevirusparticles．[Methods]TheHIF—letgem wasamplifiedfrompEGFP—N1一HIF一10【vectorandclonedintoapLenti6．3一MCS—RES2一EGFPlentiviralvectortoob~inthelentiviralexpressingvecto~ pLenti6．3一HIF—la—ItLES2一EGFP．293Tcellswereusedaspackagingcells．Thetargetplasmi dpLenti6．3一 HIF—lct—IRES2一EGFP,togetherwithpackag‘ ingplasmidswereCO—trnasfectedinto293T cellsusingcalcium phosphatetransfectionmethod．After48h．cellculturesupematantwascollectedandfiltrated Then293T cellswereexposedtolentivimswithdifferentmultiplicityofinfection．Transfectionefficiencywasestimatedbyevaluationofthegreenfluores‘ centproteinexpressionviafluorescencemicroscopy．R【esulb1TherecombinantlentiviralvectorpLenti6．3一HIF—la—IRES2一EGFPwhichCO—expressedthi HIF—letandEGFPgenewasconstructedandverifiedbyPCRandsequencing．Thetiterofthepackagedlentiviralviruswas4x106TU／m1．C【onclusion]Tht recombinantlenfiviralvectorpLenti6．3HIF—let—IR．ES2一EGFPwasconstructedsuccessfullyandcouldbeeffectivelyusedtopackagethelentivir