用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白开题报告.docVIP

开题报告 1983年，Volkman等。 发现AcNPV能够侵入一些脊椎动物细胞系中，同年和次年，Groener和TjiaH 等也分别发表文章报道AcNPV可以侵入哺乳动物细胞。此外，在上述三例报道中均未检测到子代病毒产生，亦无病毒基因组复制表达。以上研究结果表明杆状病毒可以侵入哺乳动物细胞，但是其病毒基因组在哺乳动物细胞中不能复制和转录。这些研究为将杆状病毒发展成为介导外源基因进入哺乳动物细胞表达的新型基因转移载体提供了理论依据。 2.2 在昆虫细胞中装配形成的HCV-VLP HCV为单正链RNA病毒，基因组RNA长约9.5kb，仅有一个开放读码框架(ORF)，编码一约3011个氨基酸的多聚蛋白前体，该前体蛋自在宿主信号肽酶及病毒蛋白酶作用下，裂解为病毒的结构蛋白与非结构蛋白。HCV结构蛋白包括核，c、蛋白(C)、包膜蛋白-1(E1)和包膜蛋白-2(E2)。核心蛋白和HCV基因组RNA构成核衣壳，在其外面再围上包膜蛋白就组成了完整的HCV病毒体(Virion)。人们一直试图从组织中培养HCV，Bautenschlager把截短的HCV基因组插入人的细胞，用组织培养，虽表达出HCV蛋白，但没有病毒的复制。Rice等人增加所插入基因片段长度，还有学者用HCV的全氏cDNA插入人细胞，发现尽管完整的HCV基因组能在组织培养中有效复制，但所产生的各种蛋白不能形成病毒粒子，可能是细胞培养中缺少某些能让表达的各个HCV蛋白正确地包装出完整病毒的细胞因子。病毒的分离至今未成功，也未找到合适的体外细胞培养系统。丙型肝炎病毒样颗粒(Hepatitis C virus—like particles，HCV—VLP)与天然的HCV病毒体不同，它是不含HCV基因组、本身不复制而能较好地保留HCV抗原性的类病毒颗粒。 2.3 细胞内HCV病毒颗粒检测的研究动态 有许多学者尝试建立HCV感染细胞模型，并在细胞内检测病毒颗粒。如Shimizu等采用对HCV易感的淋巴细胞系进行体外培养，在接种后4天-24天收集细胞，用RT-PCR检测负链HCV RNA(即病毒复制中间体)，并以抗-HCV核心区和抗包膜糖蛋白单克隆抗体作免疫荧光(IF)检测，同时作常规电镜(EM)和酶标记免疫电镜(IEM)检测。另外，他们还接种了10只黑猩猩，并于感染后5周内开腹取肝组织用IF和EM检查。结果表明，培养后6天可一次性地检出细胞内负链HCV RNA，即复制中间体，而正链HCV RNA则在3周内均能测出。培养12天后，用IF检出细胞质内有核心蛋白和包膜蛋白，第15天阳性细胞达20％。阳性颗粒呈颗粒状，位于细胞核周围，细胞质小泡内有50nm直径的病毒样颗粒，在细胞膜的附近可见病毒样颗粒聚集。对照细胞和接种后6天前的细胞中均未见到类似颗粒。第15天，用抗核心和抗包膜抗体分别作免疫酶染色，位于核周围的细胞质内可见病毒样颗粒外膜有酶染色反应物包绕，表明抗体与颗粒结合，提示EM下所见病毒样颗粒具有HCV抗原性。 Mizuno等将HCV全基因组转染Hela G细胞，结果用免疫组织化学方法证实细胞中有核心区、包膜糖蛋白区、NS3区和NS5区等病毒抗原表达。免疫电镜下发现核心抗原定位于内质网膜上，核心抗原阳性颗粒存在于胞浆中，直径30nm；普通电镜下可在内质网池中发现一直径为45nm颗粒，外有包膜包裹。他们认为，HCV核心抗原在细胞液中合成和组装。然后在内质网中形成完整的病毒颗粒。 Choo等研究慢性感染者体内病毒颗粒存在形式与持续感染的关系，发现两种密度梯度的病毒，其包膜糖蛋白高可变区I(HVRl)序列有差别，以低密度梯度病毒HVRl区变异较为显著，并认为免疫压力是造成其基因变异的原因。由于病毒糖蛋白中和抗原表位的基因发生改变，使产生的中和抗体不能结合变异的抗原，这样就不能形成病毒一免疫球蛋白复合物，因而逃避免疫清除作用而持续在体内存在。病毒颗粒特性的研究无疑对进一步揭示病毒的生物学特性，指导抗病毒研究和发展疫苗均有重要的意义。 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容：本课题所要研究的：：[15]Nanda S et al. Hepatic transcriptome analysis of hepatitis C virus infection in chimpanzees defines unique gene expression patterns associated with viral clearance[J]. PLoS ONE. 2008,(10) 。 [16] Fukushima H et,al. Development of a novel preparation method of recombinant proteoli