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免疫印迹（Western Blotting ）的基本原理及应用 免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应， 从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Western blotting 还可用于蛋白-蛋白、蛋白 -DNA 和蛋白-RNA 相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。 Western Blotting 的protocol 种类繁多，但大同小异，基本为上述几个步骤。要得到一个完美的实验结果，不仅需要优质的抗体，同时应对整个实验 流程和体系进行严格的质量控制，才能最终达到你的实验目的。 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原 结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的 蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。 基本实验步骤 一、样品制备 对于Western Blotting 实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集， 使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等 方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。 1.样品收集 1）培养的细胞 贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS 的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。 2 ）动物组织 与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。 2 ．样品定量 样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同， 且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。 几种蛋白质浓度测定方法比较 优点 缺点 Bradford 法 迅速、灵敏 对各种纯化蛋白质反应不同 BCA 法 简单、干扰少 耗时 Lowry 法 不同蛋白差别小 干扰多，较慢 注意事项：  a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；  b. 样品浓度应适中，1×SDS 凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2 培养皿/0.1ml ，悬浮细胞按5×106 细胞/0.1ml 比例加入；  c. SDS 对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；  d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；  e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。 二、电泳 电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting 中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），该法中由 于变性的多肽与SDS 结合而带负电荷，在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和 双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（KD） 15 12-43