黄渤海中华哲水蚤现场食物的分子生物学分析方法及应用.pdfVIP

谨以此论文献给我的父母、导师及所有关心我的人 衣晓燕 黄渤海中华哲水蚤现场食物的分子生物学分析方法及应用 黄渤海中华哲水蚤现场食物的分子生物学分析方法及应用 摘 要 桡足类是海洋浮游动物的优势类群，是海洋生态系统中的重要摄食者，开展 桡足类摄食研究，对于揭示其与浮游植物等的相互作用规律，探究其在海洋生态 系统物质循环和能量流动中的作用具有重要意义。有关浮游动物及桡足类摄食研 究方法的研发，也是摄食生态学研究的重点之一。本论文所探索的分子生物学方 法是研究桡足类摄食的一种新的尝试，与以往研究桡足类摄食的饵料浓度差减 法、同位素示踪法和肠内含物色素分析法等方法相比，分子生物学方法避免了传 统方法的一些缺点和局限，结果可更好地反映桡足类现场摄食的真实情况，具有 独特的优势。 本文主要包括两部分，一部分是以阻断偏口虫纤毛虫18S rDNA基因为目的， 设计纤毛虫阻断引物和探索适宜的PCR 阻断条件；另一部分是以黄渤海常见的桡 足类-中华哲水蚤(Calanus sinicus)作为研究对象，利用基于PCR 的分子生物学检 测方法，高效地特异性扩增中华哲水蚤饵料生物的18S rDNA，揭示其现场食物 的基本组成。纤毛虫是原生动物中的常见种，有些种类会寄生在桡足类的体表或 组织内部，在PCR扩增饵料生物18S rDNA基因的同时得到的纤毛虫基因无法忽 略，这种现象会影响分子生物学方法通过基因多样性来判断生物组成的高效性。 本研究通过设计三种纤毛虫阻断引物和现有的18S non-copepod引物，最大限度地 特异性扩增除桡足类之外的真核生物的18S rDNA基因，在对不同地理位置中华 哲水蚤的现场食物组成进行分析的基础上，对中华哲水蚤的摄食选择性的问题进 行研究，探索建立适于检测桡足类现场食物信息的技术，更为准确地检测海洋桡 足类的现场食物组成、反映自然海区中桡足类与浮游植物的营养关系，为真实地 揭示桡足类在海洋食物网中的作用提供新型实用快速的检测方法。 基于PCR 扩增的分子生物学分析方法，研究设计了纤毛虫基因的阻断实验， 对三种阻断引物的阻断效果进行了测试和比对，在纤毛虫基因能够很好地被阻断 的情况下，确定了最优的阻断引物和PCR 反应条件。研究中通过提取三角褐指 藻 （Phaeodactylum tricornutum ），球等鞭金藻 （Isochrysis galbana ）和3 种桡足 类：中华哲水蚤（Calanus sinicus ）、太平洋纺锤水蚤（Acatia pacifica ）和背针胸 刺水蚤（Centropages dorsispinatus ）的基因组基因，获得了三角褐指藻和纤毛虫 - i - 黄渤海中华哲水蚤现场食物的分子生物学分析方法及应用 的18S rDNA 基因，作为内标基因的硅藻基因与纤毛虫基因等比例混合，加入不 同的纤毛虫阻断引物，在不同的PCR 反应条件下进行阻断，通过比较凝胶电泳 图像上各个电泳条带的强弱，反映了纤毛虫18S rDNA 被阻断的情况。结果表明： 最优的阻断引物为 Ciliate18Sblk1 ，具有较好阻断效果的阻断条件为：3 min at 94°C ；5 cycles of 10 sec at 95°C，60sec at 68°C ；30 cycles of 95°C for 10 sec，54.2°C for 30 sec，72°C for 40 sec ；10min at 72°C。 在上述研究基础上采用18S non-copepod 引物和Ciliate18Sblk1 纤毛虫阻断引 物对黄渤海水域的中华哲水蚤饵料生物的18S rDNA 进行扩增，对中华哲水蚤的 饵料食物多样性进行了研究。对筛选出的103 条18S rDNA 序列进行分析，结果 显示，6 月份黄渤海中华哲水蚤的饵料食物组成包括甲藻，硅藻，金藻，隐藻， 裸藻；也很有可能包括水母类、箭虫、海胆以及文昌鱼的卵、幼体或者是其残体 有机碎屑颗粒。 关键词：中华哲水蚤；纤毛虫；现场食物；18S rDNA；黄渤海