华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析.pdfVIP

维普资讯 中国寄生虫病防治杂志 2005年 2月 第 18卷第 1期 Chin J ParasitDisC011 February2005，Vo1．18，No ． 1 · 论著 · 华支睾吸虫3一磷酸甘油醛脱氢酶基因的 克隆、表达和序列分析* 吴德 ，吴忠道 ，胡旭初 ，何 东苟，黄艳 ，余新炳一 (中山大学 中山医学 院病原生物学部 ，广东广州 510089) 【摘要】 目的 通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库 ，寻找、识别新基 因，并将其编码 区克隆到原核表达质粒 pGEX一4T一1中，表达 出融合蛋 白，为进一步研究其功能奠定基础 。 方法 用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA质粒 文库进行 PCR扩增 ，对产物为 500bp以上的质粒进行测序 ，测序结果在 NCBI和 ExPasy网站上进行序列分析，识别华 支睾吸虫新基因，并应用 ORFfind、Clustalw 、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行开放 阅读框、进化树及结 构域分析 。根据 pGEX一4T一1上的多克隆位点及所发现的新基 因cDNA编码序列设计引物 ，进行 PCR扩增 ，扩增产物 回 收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX一4T一1上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定，并对鉴定过 的重组体 进行诱导表达 ，表达产物经 SDS电泳鉴定。 结果 发现 CsGAPDH基因，完整 阅读框含 1017个碱基对 ，编码 339个氨基酸 ，理论分子质量单位为 37．02409ku，理论 pI为 6．66。序列分析显示 ，CsGAPDH与曼 氏血吸虫 GAPDH 的同源性为 78 ，具有 GAPDH保守功能域 。所构建的重组原核表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定与 目标基 因相符 。 SDS电泳显示表达产物在 63ku处有 1条特异性条带。 结论 发现华支睾吸虫 GAPDH基 因，成功构建重组 原核表达质粒并表达 出融合蛋 白。 【关键词】 华支睾吸虫；磷酸甘油醛脱氢酶 ；克隆；原核表达 ；序列分析 【中图分类号】 R383．22 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001—6627(2005)O1—0028—05 3一磷酸甘 油醛脱氢 酶 (Glyceraldehyde一3-phos— 原虫体内存在两种 GAPDH 同工酶，一种位于类似微 phatedehydrogenase，GAPDH)是糖酵解过程中的关 球体的细胞器中，另一种位于细胞浆中，这两种同工酶 键酶，它催化 3一磷酸甘油醛转变成 1，3一二磷酸甘油 在氨基酸水平上只有 55 的同源性 ]。本研究通过 酸 ，后者作为底物在 3一磷酸甘油酸激酶催化下生成 3一 筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库，寻找、识别出 磷酸甘油酸 ，在这一反应过程 中产生糖酵解过程的第 华支睾吸虫 GAPDH(CsGAPDH)新基 因，并将其编 一 个 ATP。由于参与了细胞 的基本代谢过程 ，它被认 码区克隆到原核表达质粒 pGEX-4T-1中，表达出融合 为是看家 (Housekeeping)基因山。在过去的 30年里 ， 蛋 白，为进一步研究其功能奠定基础。 人们主要对 GAPD