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中国科技论文在线 重组FLAG 标签的筛选、鉴定及与新型荧光蛋白 的融合表达 易科，高晓莲 浙江理工大学生命科学学院，杭州（310018 ） E-mail ：yike311@126.com 摘 要：以 FLAG 标签的原始序列 DYKDDDDK （FLAG4 ）为模板，设计 4种新FLAG 标签 FLAG1 （DYKDYKYK ）, FLAG2 （DYKGGGYK ）, FLAG3 （DYKDYKDYK ）和 FLAG5 （DYKDEDDK)与新型绿色荧光蛋白（G2 ）、红色荧光蛋白（H10 ）融合，Western blotting 分析表明抗 FLAG 单克隆抗体 M2 （AFM2 ）能够特异性识别 G2-FLAG4 、G2-FLAG5 、 H10-FLAG3 、H10-FLAG4 、H10-FLAG5 五种 FP-FLAG 融合蛋白。采用非竞争性 ELISA 固 相法,计算出 FP-FLAG 融合蛋白与单克隆抗 FLAG M2 抗体(AFM2)的亲和常数。AFM2 与 G2-FLAG4 、G2-FLAG5 的亲和常数分别为 1.67E+11、4.65E+10 ，AFM2 与 H10-FLAG3 、 H10-FLAG4 、H10-FLAG5 的亲和常数分别为 6.49E+10、1.47E+11、6.63E+10。结果表明FLAG 原始序列 DYKDDDDK 与 AFM2 之间的亲和力最高，DYKDEDDK 、DYKDYKDYK 次之， DYKDYKYK 和 DYKGGGYK 不能与 AFM2 特异识别。在 FLAG 融合蛋白的纯化应用中， 运用这些 FLAG 标签的亲和力差异，在同一纯化体系下通过设计不同的洗提次序和洗提条 件，可以达到逐步分离不同目的物的效果，且荧光蛋白本身作为一种标记物，与重组 FLAG 标签融合形成一个双功能融合蛋白，为今后 FLAG 融合蛋白的纯化与检测提供了新的思路 和理论基础。 关键词：重组 FLAG 标签；新型荧光蛋白；非竞争性 ELISA；亲和常数；双功能融合蛋白 中图分类号：Q816 1. 引 言 随着蛋白质组学的飞速发展，各种亲和标签的使用日益频繁。亲和标签通常是指能够与 目标蛋白融合表达的具有亲和配基的多肽或者蛋白。亲和标签的分子量大小不一，既有大的 蛋白质分子（或蛋白质结构域及其衍生物），如GST、MBP 等，也有小的多肽片段如FLAG-tag 、 Poly –His tag 、Poly-arg- tag 等。其中，FLAG 亲和标签是一种由八个氨基酸残基 DYKDDDDK 组成的表位标记物，FLAG 亲和标签序列简短，融合表达后对目标蛋白的结构和生物活性 影响小，可以用一条人工合成的寡聚核苷酸来编码的特点使其得到广泛的应用[1, 2] 。FLAG 肽序列（DYKDDDDK ）的亲水性很强，片段小，并且具有肠激酶的酶切位点，一般不会影 响目标蛋白的活性。尽管序列简短，八个组成FLAG-tag 的氨基酸残基排列却并非随意，FLAG 的抗原作用与这八个氨基酸的序列位置息息相关。酸性氨基酸Asp 是 FLAG 序列的第一个 氨基酸，它位于 N 端且带负电荷，FLAG 序列的第二个氨基酸是芳香族氨基酸 Tyr，它在抗 原-抗体相互作用的过程中起很大作用，在高极性环境中带电荷酸性氨基酸 Asp 与芳香族氨 基酸 Tyr 相互辅助，使得抗原性大大提高。接下来六个氨基酸残基（KDDDDK ）具有很强 的亲水性，并且这段亲水性极强的序列在蛋白表达时能形成高度暴露的三维结构，使得 FLAG 标签抗原性进一步提高。 根据不同的抗原结合要求，目前已开发出三种抗 FLAG 的单克隆抗体：M1 、M2 和 M5 利用 FLAG 标签可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统。为了拓展 FLAG 标签 2+ 的应用领域，后来开发出了单克隆抗体M2 。M2 单抗与 FLAG 标签的