pEGFP-N1TNFR1载体的构建及鉴定1.pdfVIP

pEGFP-N1/TNFR 1 载体的构建及鉴定1 叶顺传，曾秋棠，吴辉文，吕云波 华中科技大学同济医学院协和医院心研所，湖北武汉（430022 ） E-mail ：yeshunchuan@ 摘 要: 目的:本研究旨在构建人肿瘤坏死因子受体（TNFR 1 ）绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP-N1/TNFR 1 ，为研究TNFR 1 细胞内转位奠定实验基础。方法：培养U937 细胞，提 取RNA ，RT-PCR 扩增出TNFR 1 cDNA 基因片段，将TNFR 1 基因的RT-PCR 纯化产物及 质粒pEGFP-N1 DNA 经Sac I 和Kpn I 双酶切、胶回收纯化酶切片段后，体外连接酶切片段， 使其定向重组，再将重组DNA 转化E. coli DH5α感受态细胞，经复苏后，在含Kanr 的LB 固体培养基上筛选出阳性克隆。结果：挑取的LB 固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定， 证实均为阳性克隆，即TNFR 1 与pEGFP-N1 体外重组成功。结论：采用体外重组技术，成 功地将人TNFR 1 cDNA 插入了荧光蛋白表达载体pEGFP-N1 中。 关键词：TNFR 1；真核表达载体；质粒pEGFP-N1 ；克隆 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor ，TNF ）是具有多功能的多肽，在炎症反应中起重 要作用。在介导细胞损伤的过程中，TNF 主要结合并活化TNF 受体（TNF receptor 1，TNFR 1），然后TNFR 1 激活下游信号通路，这些通路在心肌细胞和血管内皮细胞凋亡起其调节作 用[1] [2] ，但TNFR 1 细胞内转位通路及调节因子尚不明确 。 绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein , GFP)是20 世纪90 年代中期发展起来的一种全 新的报告分子。GFP 分子质量小, 易与其他目的基因形成融合基因, 对细胞无毒副反应, 而 且其化学性质稳定, 使用方便, 可以在活体细胞中定时观察, 所以连接有 GFP 的载体 pEGFP-N1 在分子生物学中被广泛应用。 本研究旨在构建以GFP 为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1/TNFR 1 ，为下一步转染 人脐静脉血管内皮细胞并观察其表达情况，进一步研究TNFR 1 细胞内转位通路及调节因子 奠定基础。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂： Trizol 试剂购自Invitrogen 公司。RT-PCR 试剂盒购自大连宝生物。PCR 产物纯化试剂盒 购自Promega 公司。质粒抽提试剂盒、DNA marker 购自北京天根生化。T4 DNA 连接酶、 限制性内切酶Kpn I 、Sac I 购自NEB 公司。国产胎牛血清购自杭州四季青。RPMI 1640 培 养基为Hyclone 公司产品。引物的合成和序列测定由上海生工完成。 1.2 细胞、质粒与菌株： U937 细胞、质粒pEGFP-N1 由华中科技大学同济医学院免疫学国家重点实验室惠赠， DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）。 1.2 方法 1.2.1 U937 细胞培养                                                                1本课题得到教育部博士点专项基金资助项目（20040487067 ）的资助。  -1- 人类白血病细胞U937 细胞株接种于含有10% 胎牛血清、青霉素100 U/ml 及链霉素100 U/ml 的RPMI 1640 培养液中，于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养，每2 天换液1 次