岷县、漳县产当归基于ITS序列的变异位点和分子进化分析.pdfVIP

璃 仲鏖 2010年第23卷第12期GansuJournalofTCM,2010VoL23No．12 岷变 县＼漳县产当归基于 ITS序列的 异位点和分子进化分析 王宏伟 ，，徐 燕 ，李海龙 z 1 甘肃中医学院附属医院，甘肃 兰州 730020；2 甘肃中医学院 摘 要 目的：建立甘肃当归功效的分子系统学基础，为甘肃当归 “道地性”提供分子依据。方法：采用PCR技术 获得 ITS基因，进行测序，经软件进行统计分析，计算各样本间的遗传距离并采用距离矩阵法构建 NJ系统发育树， 分析种群问的关系。结果：甘肃岷、漳两县当归ITS序列差异极小，分子进化分析显示岷漳两县产当归与欧当归的关 系较近，但不与当归属其他植物聚合，是当归属中一个特殊类群。结论：ITS序列特征可以作为当归种间鉴别的有效 分子标记，岷漳两县这种特殊的环境正是 “岷当归”这一特殊种群形成的主要原因。 关键词 当归；ITS；序列分析；道地性 中图分类号：R282．71 文献标识码：A 文章编号：i004-6852(2010)I2-0068-02 当归别名岷归 ，为伞形科多年生草本植物当归 ngelicasinensis 中1O分钟，取出后用研钵研细，筛网过滤后称 (Olw．)Diels]的干燥根。当归为著名常用中药，药用历史悠久，历代本草 取细粉 5Omg，然后按照上海生工产UN10--10 均有记载，始记于 奉《农本草经》，有补血活血、润肠调经之功效，是临床使 柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取，提取 用频率最高的中药之一，素有“十方九归’’之称。我国当归主产于甘肃东南 的基因组DNA一20℃保存，备用。 部，以岷县产量高，质量好，其次为云南，四川、陕西、湖北等省均有栽培【。 1．3 ITS序列扩增 以已经发表于genebank [== 甘肃是我国最大的当归产区，年产量 占全国的95％以上[，甘肃产的当 中的当归ITS序列为标准，设计一对引物，引 一一 归，个大质优，称 “秦归’ 西‘归”，销往全国并大量出口。2001年岷县被 物序列为：ITS正，6TTGTCGAATCCTGCAATAGC； 中国农学会授予“中国当归之乡’’称号。 ITS反，5，_TCG从GCGCACAGAGTATG (引物 由上 药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题，但由于道地药材 海生工合成)。PCR反应体系为5O ，其中 与非道地药材在形态和生药上基本一致，所以传统方法已不能满足道地 2xMaster25 ，上下游引物各5 ，模板 药材的现代研究。道地药材是一个地域性现象，其产生除了与栽培方法、 1 ，ddH2014 。PCR扩增条件：94C预变 生态环境、加工方法有关外，还与物种居群的遗传特异性有关。在植物系 性 1分钟，94℃变性 1分钟 ；53℃复性 1分 统与进化研究中，核酸分子量是最基本的进化单位，能反映进化本质；核 钟；72℃延伸 1分钟；共 35循环 ，72℃延伸 酸的基本序列是一元变化的，通常为点突破，趋同效应极小，以核酸分子 1O分钟，4C保存。 为指标确定的系统化关系不受主观因素影响。本实验将 ITS序列分析应 1．4 序列测定和分析 PCR产物经琼脂糖 用于甘肃中药材当归道地性的研究。 凝胶电泳检测后由上海生工测序，每个样品 1 材料与方法 均采用双向测序 。测序结果以已经发表于 1．1 实验材料 本实验所用材料均为2005年采 自甘肃省岷县及漳县地 genebank中的当归 ITS序列确定 ITS序列 区农民种植的当归种子，自然干燥后备用，实验材料经甘肃中医学院张西 的边界，并进行两端碱基手工修订。各序列特 玲教授鉴定后应用于实验。所用具体实验材料见表 1。