猪胸膜肺炎放线杆菌PCR分群研究.pdfVIP

山地 农 业 生物 学报 28(1)：83—86，2009 Journal of Mountain Agriculture and Biology 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR分群研究枣 李健华 ，周碧君 ，2．，文 明 ，一，王开功 r，汪德生 ’ (1．贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025；2．贵州大学 动物疫病研究所 ，贵州 贵阳 550025) 关键词 ：传染性胸膜肺炎放线杆茵；外膜脂蛋白A；PCR；血清群 中图分类号：$852．61 文献标识码：A 文章编号：1008—0457(2009)01—0083—04 Serum groupclassificationofActinobacillusupleuropneumoniae(APP)asrevealedbyPCRtech· nique L／Ji口n．hua，ZHOUBi-jun．一，WENMing ，WANGKai-gong ，WANGDe．sheng (1．CollegeofAnimalScience， GuizhouUniversity，GuiyangGuizhou550025，China；2．Anima lDiseaseInstituteofGuizhouUniversity，Guiyang Guizhou550025，China) Keywords：Actinobacilluspleuropneumonia；OutermembranelipoproteingeneA；PCR；Serum group 猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropnemonia，PCP)是猪的一种以急性出血性和慢性纤维素性 的胸膜肺炎病变为特征的呼吸道传染病-1]。该病是影响世界集约化养猪场健康发展的三大呼吸道传染 病之一。其病原体为猪胸膜肺炎放线杆菌(ActinobaciUuspleuropneumoniae，APP)，可分为2个生物型，即 生物 I型和生物 Ⅱ型。其中生物 I型菌株的致病力强于生物 Ⅱ型菌株，而生物 I型菌株又可分为 l2个血 清型 J。研究表明 J，APP各血清型菌株在其他国家或地区的分布不尽相同，且各血清型间交叉保护性 不强，使得该病的免疫防制工作有较大困难。因此，笔者在GRAMT等 研究的基础上，根据不同血清型 APP外膜脂蛋 白A(TheoutermembraneLipoproteingeneA，OMPA)基因两端保守而中间变异的特点设计了 4对群特意性引物，对APP菌株毒力强弱进行分群研究。 1 材料与方法 1-1 菌株 9株猪胸膜肺炎放线杆菌标准菌株编号为CVCC259(血清型 I)、CVCC260(血清型 Ⅱ)、CVCC261(血 清型Ⅲ)、CVCC262(血清型Ⅳ)、CVCC264(血清型Ⅵ)、CVCC265(血清型Ⅶ)、CVCC266(血清型Ⅷ)、 CVCC267(血清型Ⅸ)和CVCC268(血清型X)，购 自中国兽药监察所；对照菌株有支气管败血波氏杆菌、奇 异变形杆菌、都柏林沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌、铜绿假单胞菌和多杀性巴氏杆菌等，为 贵州大学预防兽医学专业实验室保存；猪传染性胸膜肺炎3价灭活疫苗(含血清 I、Ⅱ和Ⅶ型APP)，购 自 武汉科前动物生物制品有限责任公司，批号为070812。 1．2 试剂 酵母浸出物、蛋白胨、琼脂糖、NAD等，购 自昆明绿盟科技有限公司；Tag酶、dNTP、DNAMa~er等，购 自上海生物工程技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯。 收稿 日期：2008—09—02；修回日期：2008—10一o3 基金项目：贵州省自然科学基金项目资助[黔科合字(2007)2067]；贵阳市农业局科技计划项 目资助(zo74oo2) 作者简介：李健华 (1981一)，男，贵州福泉人，2006级硕士研究生，从事动物病原微生物研究。 通讯作者 ：E—mailas．bjzhou@gzu．edu．ca 山地 农 业 生 物 学 报 2009正 1．3 菌株复苏 取9株不同血清型APP标准菌株，分别划线接种于含NAD的巧克力琼脂平板上，37~C培养24—48h， 待其生长出明显的菌落。 1．4 细菌DNA提取 取各血清型APP单个菌落， 别放人含 1．5mL灭菌ddHO的2mL离心