改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体.pdfVIP

生 物 工程 学报 ChinJBiotech2011，June25；27(6)：926—934 journals．im．ac．cn ChineseJournalofBiOtechnOIOgy ISSN 1000—3061 cjb@im．ac．crl @2011CJB，Allrightsreserved． 改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双 表达穿梭载体 郑其升 ，毕志香2李梅清2侯继波 ，陈溥言 1国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014 2山东省畜牧兽医职业学院，潍坊 26106】 3南京农业大学 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，南京 210095 摘 要：为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体，利用Cre／LoxPDNA重组系统 以及本实验室表达Cre酶的BHK一21细胞系 (BHK—Cre)，以大肠杆菌黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Ecogpt)为筛选 标记构建可删除筛选标记的双表达穿梭载体 pLR-gpt。将 Ecogpt基因以及调控其表达的启动子基因置于 2个同向的 LoxP位点之间，2个独立的多克隆位点位于2个LoxP位点之外，最终获得的重组病毒可以在BHK．Cre细胞系上删除 筛选标记Ecogpt。为了验证系统的有效性 ，将 PRRSVNJ—a株 ORF5与 ORF6基因分别克隆入 pLR-gpt的2个多克隆 位点中，构建重组转移载体 pLRgpt—ORF5／ORF6。经脂质体介导，将pLRgpt—ORF5／ORF6转染已感染亲本 MVA2h的 BHK一21细胞单层，用药物选择性培养基 (MXHAT)在 24孔板上进行连续筛选纯化，得到带有筛选标记的重组病毒 rMVAgpt—GP5／M。将 rMVAgpt—GP5／M 感染 BHK—Cre，获得删除筛选标记的重组病毒 rMvA—GP5／M，Westernblotting 与间接免疫荧光证明重组病毒能表达 GP5与 M 蛋白，经 PCR和病毒生长曲线鉴定，获得删除筛选标记的重组病毒 rMVA—GP5／M 已经完全删除筛选标记 gpt。结果表明成功构建了痘苗病毒表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体， 并且外源基因的插入不影响亲本病毒的复制与外源基因的表达，具有较好的稳定性。 关键词：CreL／oxP，MVA 表达系统，猪繁殖与呼吸综合征病毒，无标记重组病毒 A noveldoubleexpressionshuttlevectortogetmarker-free recombinantmodifiedvacciniavirusAnkara QishengZheng，ZhixiangBi2,MeiqingLi，JiboHou，andPuyanChen lNationalResearchCenterofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnology，Nanjing210014，China 2ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege，Weifang261061，China 3KeyLaboratoryofAnimalDiseaseDiagnosisandImmunoloyg，MinistryofAgriculture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China Received：August16，2010；Accepted：November22，2010 Supportedby：ChinaPostdoctoralScienceFoundation(No．20080441060)，JiangsuAgriculturalAcademyScienceFoundation(No．6110820) Correspondingauthor：JiboHou．Tel：+86—25—843962008；Fax：+86-25E-mail：houjibo@jaas．ac．cn 中国博士后基金 (No．20080441060)，江苏省农业科学院基金 (No．6110820)资助 。 郑其升等：改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体