靶向传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2有效miRNA的筛选.pdfVIP

l270 江苏农业学报 (Jiangsu ofAgr．Sci．)，2010，26(6)：1270～1276 王永娟，崔平福，孙怀昌．靶向传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2有效rrdRNA的筛选[J]．江苏农业学报，2010，26(6)：1270—1276 靶向传染性法 氏囊病病毒 (IBDV)VP2有效 miRNA 的筛选 王永娟 ， 崔平福 ， 孙怀 昌 (1．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300；2．昆山出入境检验检疫 局，江苏 昆山 215300；3．扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009) 摘要： 为筛选出能有效抑制传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因复制的miRNA，采用RT—PCR方法从病毒基 因组中进行结构蛋 白VP2的基因扩增与序列测定，构建融合表达载体pVP2一EGFP。根据VP2测序结果，借助genseript 软件设计针对 VP2的5条miRNA，分别命名为miVP2A、miVP2B、miVP2C、miVP2D和miVP2E，将合成的5条miRNAs 分别插入到pRFPRNAiC中形成miVP2s表达载体，这些载体分别与pVP2一EG}’P共转染DF一1细胞系，通过Northering B1t，tting方法检测miVP2 的表达，利用荧光共聚焦显微镜定性、流式细胞术定量的方法进行有效 m ，P2s的筛选。结 果显示：miVP2s能成功表达；转染miVP2s表达载体组的绿色荧光蛋 白(GFP)强度和数量都明显弱于或少于阴性对照 组；miVP2s对 VP2的抑制效率为59．7％ 到78．5％。表明所设计的mlRNAs对 VP2均有抑制作用，其中miVP2A和 miVP2E效果最为显著。 关键词： 传染性法氏囊病病毒 (IBDV)；VP2；miRNA；荧光共聚焦 ；流式细胞术 中图分类号： $852．65 文献标识码 ： A 文章编号： 1000-4440(2010)06—1270~7 Selection forEffectivemiRNA Targeting GeneofInfectiousBursal DiseaseVirus WANGYong-juan’． CUIPing—fu． SUNHuM—chang (1．JiangsuAnimalHusbandryandVeterinaryCollege，JiangsuPrm’incialKeyLaboratoryofVeterinaryBio-pharmaceuticalHight·echResearch，Taizhou 225300，China；2．KunshanEntr)一exith~spectionandQuarantiaeBureau，Kunshan215300，China；3．CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniver— sity，Yangzhou225009，China) Abstract： TogeteffectivemiRNAstargetingtheVP2geneofinfectiousbursaldiseasevirus(IBDV)， gene from IBDV genomicRNA wasamplifiedbyRT—PCR，thenwasclonedintopEGFP andareportervectorpVP2一EGFPwas sturctured．Afterthat，fivemiRNAs(namedmiVP2A，miVP2B，miVP2C，miVP2DandmiVP2E，respectively)targeting W)2geneofIBDVwerepredictedusing web—basedtoolsoftwear(genscript)，andtheywereinsertedintomiRNAexpres— sionvector(pRFPRNAiC)andCO—IranslectedintoDF一1cellswithpVP2一EGFP．ExpressionofmiVP2sweredemonstrated byNortherndotblotting，andtheirsilencingeffect