根癌农杆菌Ti质粒的提取和ipt基因的重组与转化.pdfVIP

根癌农杆菌Ti 质粒的提取和 ipt 基因的重组与转化 韩烁 王佳 许鹤煊 刘楠 李波 王宜欣 【实验目的及原理】 本实验是提取根癌农杆菌天然Ti 质粒上的ipt基因，并将它转入大肠杆菌中进行表达。ipt 基因位于根癌农杆菌Ti 质粒上T-DNA 区域，是编码异戊烯基转移酶的基因。此酶是细胞分裂素 合成中最重要的限速反应酶。首先设计引物，利用PCR 技术以Ti 质粒为模板，扩增ipt 基因。 之后将其与表达载体 PET-21 连接，转入大肠杆菌中进行诱导表达。SDS检测表达蛋白， 生物鉴定法检测细胞分裂素活性。 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 1．超净工作台 2．漩涡震荡器 3．低温离心机 4．台式离心机 5．PCR 热循环仪 6．超声破碎仪 7．恒温水浴器 8．恒温摇床 9．恒温箱 10．琼脂糖凝胶电泳系统 11．平板电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子，恒压恒流电泳仪 （二）材料 1．根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens str c58） 2．无水乙醇 3．氯仿 4．琼脂糖 5．TAE 电泳缓冲液 6．上样缓冲液及SYBR 7．DNA 回收试剂 8．TE 溶液 9．PET-21 质粒 10．大肠杆菌DH5 α 11．LB 液体培养基 12．十二烷基硫酸钠（SDS） 13．NaOH 14．Tris 碱 PDF 文件使用 pdfFactory 试用版本创 15．EDTA 16．NaAc （三）试剂 1．10%Aps 2．TEMED 3．Acr/Bis(30%) 4．10% (W/V) SDS 5．1.5 mol/l Tris •HCl (PH=8.8) 6．1mol/L IPTG 7．0.1 mol/L CaCl2 8．氨苄 （100 μg /ml ） 9．10×ligase buffer 10．T4 DNA ligase 11．3mol/L KAc （PH5.2 ） 12．70%乙醇 13．5mmol/L dNTP Mixture 14．10×PCR buffer (含Mg) 15．Taq 酶 16．BamH Ⅰ, EcoR I 17．MG/L 液体培养基 18．1 mg/ml 溶菌酶溶液：溶于TE 缓冲液 19．LS 裂解液：3% SDS ，0.2mol/L NaOH 20．Ts 溶液:1mol/L Tris, 4mol/L NaOH (PH 7.0) 21．TES 溶液：50mmol/L Tris, 5mmol/L EDTA, 50mmol