实验一E·Coli质粒DNA的提取一、实验目的.pdfVIP

实验一 E·Coli质粒DNA的提取 实验一 E·Coli质粒DNA的提取 实实验验一一 EE··CCoollii质质粒粒DDNNAA的的提提取取 一、实验目的 一、实验目的 一一、、实实验验目目的的 通过本实验学习和掌握细菌质粒的提取、纯化技术以及使用琼脂糖凝 胶电泳技术对其进行分离鉴定的技术，为从事基因工程和分子生物学研究 奠定初步基础。 二、基本原理 二、基本原理 二二、、基基本本原原理理 质粒是一种存在于细菌染色体外的稳定遗传因子，是双链闭合环状结 构的DNA分子，具有自主复制和转录能力，使子代细胞可表达所携带的遗 传信息。质粒可以独立的游离于细胞质中，也可以整合到细菌染色体中。 从大肠杆菌中提取质粒DNA的方法很多，其中的碱性SDS法提取质粒 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异而予以分离的。碱裂 解法分离质粒DNA的方法包括三步：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集 和裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁， SDS可以使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在强碱性条件下，染色体 DNA和质粒DNA均变性（双链解开）。由于质粒DNA是共价闭合环状超螺旋 结构，变性后两条互补链不会完全分开。当溶液pH 调节到中性时，质粒DNA 容易复性并溶解到溶液中，而染色体DNA不容易复性，互相缠绕，在离心 时极易和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。转移出上清液，再用乙醇沉 淀出其中的质粒DNA。 三、实验材料 三、实验材料 三三、、实实验验材材料料 1.菌种 带质粒pBluescript SK-的大肠杆菌。 2.仪器 （1）高压蒸汽灭菌锅 （2）超净工作台 （3）恒温振荡摇床 （4）台式高速离心机 （5）低温冰箱 （6）电泳仪（附水平电泳槽、电源稳压器） （7）微量加样器 （8）凝胶成像系统 （9）离心管及管架 （10）制冰机 3.试剂 （1）LB培养基 950ml去离子水，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物， 10gNaCl，在容器中溶解后调节pH至7.0，加去离子水定容到1000ml，在 1.1kg·cm 高压下灭菌20min。2 -1 （2）氨苄青霉素 用无菌水配成100mg·ml 的母液，使用浓度为100 -1 μg·ml 。母液4℃保存可使用1周。－20℃保存可使用6周。 -1 （3）GTE缓冲液（溶液Ⅰ） 25%的蔗糖，50mmol·L 的Tris—HCl -1 （pH8.0），100 mmol·L 的EDTA。 -1 （4）NaOH—SDS溶液（溶液Ⅱ） 0.2 mol·L 的NaOH，1%（W/V）的SDS。 （5）KAc缓冲液（溶液Ⅲ） 称取KAc29.44g，溶解后加入冰乙酸23ml， 混合均匀后加水定容到100ml即可。 -1 -1 （6）TE缓冲液 10 mmol·L 的Tris—HCl（pH8.0），10 mmol·L 的EDTA。 （7）无水乙醇 （8）70%乙醇 用无水乙醇或95%乙醇配制即可。 （9）琼脂糖 （10）上样缓冲液 0.25%溴酚蓝，0.25%的二甲苯青FF，30%的甘油 水溶液，4℃保存。 （11）电泳缓冲液（10×TBE） 54g Tris，27.5 g硼酸，20ml 0.5mol·L-1 的EDTA（pH8.0），定容到1000ml，使用时稀释10倍。 （12）染色液（贮存母液） 50m