金银花中多酚氧化酶和过氧化物酶的分离纯化及特性研究.pdfVIP

I II 摘要 本研究以山东亚特良种金银花为原料，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE 纤维素 -52离子交换柱分离纯化金银花中PPO 和POD，并分别对这两种酶的分子量和 特性进行了研究，包括温度和pH 值对酶活性的影响，酶活性对温度和pH值的 稳定性，底物的专一性，金属离子及抑制剂对酶活性的影响，为金银花贮藏和加 工过程中的酶促褐变的抑制提供科学依据。通过分析，主要研究结果如下： 1、通过硫酸铵分级沉淀和离子交换层析，金银花PPO纯化倍数为30.76， 回收率33.8%，分子量约为49kDa。金银花POD纯化倍数28.95，回收率17.52， 变性分子量约为20.4kDa。 2、金银花PPO粗酶液最适反应温度为30℃；20℃、30℃加热60min 剩余 相对酶活力分别为 80%和53%；40℃、50℃加热60min 后相对残余酶活力低于 40%；60℃处理60min 相对残余酶活力为10%；70℃时酶活力几乎完全丧失。 金银花PPO最适反应pH 值为7.5，在pH 值7.5~9.5较稳定，相对残余酶活力大 于90%。金银花POD粗酶液最适反应温度为30℃；20℃、30℃加热60min 残 余酶活力在90%以上，60℃处理60min 相对残余酶活力小于10%；金银花POD 最适反应pH 值为5.5，在pH值8.0时较稳定。 3、金银花PPO属于双酚氧化酶，可以氧化临位双酚（邻苯二酚、L-dopa、 绿原酸），不能氧化单酚（L-tyrosine）和三酚（没食子酸、焦性没食子酸、甲基 没食子酸）。金银花POD具有广泛的底物特性，在H O 条件下可以氧化酚类和 2 2 芳香胺类化合物（愈创木酚、邻苯二酚、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、焦性没食子 酸、邻联茴香胺、联苯胺）。 + + 2+ 2+ 2+ 4、金属离子Na 、K 对金银花PPO 酶活力没有影响；Mn 、Mg 、Ca 、 2+ 2+ 2+ Zn 有激活作用；Cu 、Co 表现为抑制作用。SDS对PPO活力有激活作用；亚 硫酸钠、柠檬酸、抗坏血酸、曲酸和托酚酮对PPO有不同程度的抑制作用。金 + 2+ 2+ + 2+ 属离子Na 对金银花POD酶活力没有影响；Ca 、Zn 有激活作用，而K 、Mn 、 2+ Mg 表现为抑制作用；抑制剂（柠檬酸、抗坏血酸、曲酸、托酚酮、DTT，等） 及表面活性剂（SDS、TritonX-100、Tween-80）对金银花POD均有一定的抑制 I 作用。 关键词：金银花；多酚氧化酶；过氧化物酶；分离纯化；特性 II Abstract LonicerajaponicaThunb. is a kind of important Chinese medicine material, with the effects of antibacterial and anti-inflammatory. At present, severe browning phenomenoneasilyoccurs during storageand processing ofLonicerajaponicaThunb. Color is one important judgment standard for its commercial grade provided by the State Administration of traditional Chinese medicine and the health ministry. Therefore, it has the important significance to study the deterioration mechanism of L