国境口岸肠出血性大肠杆菌 O104H4检测方法.docVIP

前 言 本标准附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心传染病控制所。 本标准主要起草人：涂承宁、杨泽、熊衍文、莫秋华、谭华、叶立青。 本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。 国境口岸致泻性大肠埃希菌检验方法 范围 本标准规定了国境口岸EHEC O104:H4检验的检测流程、样品采集与运输、样品处理、检验和报告。 本标准适用于对国境口岸EHEC O104:H4的检验。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.6《食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验是指能使人、动物(esp.婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。致泻性大肠埃希氏菌可分为五类，分别为产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、 肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC) 、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、 肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)和肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)。 仪器设备 天平 均质器或乳钵 温箱：36℃±1℃，42℃。 500mL灭菌广口瓶 显微镜 载玻片 酒精灯 接种棒 灭菌的刀子、镊子、勺子。 菌浓度比浊管：Mac Farland3号 麦康凯琼脂； 伊红美蓝琼脂； 三糖铁琼脂（TSI）； 乳糖发酵管； 氧化酶试剂； 革兰氏染色液； 营养肉汤； 肠道菌增菌肉汤； 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清； 赖氨酸脱羧酶试验培养基尿素琼脂(pH7.2)氰化钾(KCN)培养基蛋白陈水、靛基质试剂 样本采集 样本采集原则 标本采集的好坏，对整个检验工作的质量影响很大。采集标本以病人粪便为主，粪便标本的采集应争取在发病早期，服用抗菌药物之前并尽快送到实验室。 采集样本时应注意避免交叉污染。 样本采集完毕，尽快消毒洗手。 采得的标本应不能立即检查的，要接种于保存培养基内，尽快送往实验室。送检标本可放入文腊氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基中。送检标本时应填写送检单。 不推荐（尽量少用）使用肛拭子采样。 拭子采样法： 可用棉拭子采取自然排出的新鲜大便； 亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3-5cm处采取。应注意棉拭大小适宜，避免采便量过少。 一般要求水样便采取1-3ml，成形便采取指甲盖大小的粪便量。在某些情况下，病人的呕吐物、沾染粪便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。 座厕采样法（推荐）： 戴上乳胶手套，取一螺旋式密封、已消毒、干燥的容器并做好唯一性标识； 使用座厕时，指导病人将厨用塑料围裙挂在座厕后背上，将围裙体部置于座厕坐板上，使能更方便地获得粪便样本，但应避免尿液混和。尽可能多地将粪便样本采集到上述容器中（推荐采集到10mL以上），置4℃保存并于2h内送检。 如果没有座厕，可使用搪瓷便盆。指导病人将围裙体部置于便盆上（如果便盆经过高压消毒，也可不用围裙），使能更方便地获得粪便样本，但应避免尿液混和。 如果是使用了纸尿布且不会使用座厕的婴幼儿，可将塑料围裙沿着纸尿布边缘放入纸尿布中，如果放置得当，可使粪便和尿液的混合减到最少，从而获得一个较好的样本。 运输与保存 采集的样本应于2h内尽快送检。否则可保存于4℃于24h内送检。同时按规定作好标识，填写申请单。 样本处理 毒素筛查 标本采集后尽早进行提取，成形粪便样本取1g到3mL 1×洗涤液中，混匀，待重颗粒沉淀下来（即澄清），取上清进行vero毒素检测。腹泻便样本取1mL到2mL 1×洗涤液中同上操作。 提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制HRP活性。 常规分离培养 取液体状、脓血状或糊状粪便或肛拭子划线接种于MAC或EMB平板。同时无菌操作取1g/mL样本加入9mL EC肉汤中，置于36℃±1℃温箱内培养18h~24h，划线接种于MAC或EMB平板。 分子生物学检验 取粪便样本或培养后EC肉汤适量提取核酸。取1.5ml菌液于1.5ml 离心管，8000rpm 离心3min，弃上清； ?用0.6ml?TE?悬菌，振荡打开沉淀； 加入80(l?10%SDS，颠倒数次混匀后，68℃水浴5–8min，至清亮； 加入RNase使终浓度为50–100(g/ml，混匀后37℃水浴作用0.5–1.0小时； 加入等体积饱和酚，上下颠倒混匀，使其完全乳化，12000 r