常见食品过敏原可视芯片检测方法.docVIP

前 言 本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本部分的附录A为资料性附录。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出。 本部分由全国进出口食品检测标准化技术委员会（SAC/TC445）归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈颖，韩建勋、邓婷婷、高宏伟、曾静、吴亚君、曹际娟、张舒亚、李志勇、侯丽萍、李富威。常见食品过敏原成分检测 可视薄膜生物传感器芯片方法 范围 本标准规定了常见食品过敏原成分的可视薄膜生物传感器检测方法。 本标准适用于食品及其原料中大豆、花生、小麦、腰果、牛、鱼、鸡、虾等8种食品过敏原成分的定性检测。 本标准所规定方法的最低检出限（LOD）为0.001%（w/w）。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测。 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准 术语和定义 3.1.1 食品过敏原 food allergen 食品中能使机体产生过敏反应的物质。常见食品过敏原主要包括大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、鱼、蛋类及甲壳纲动物等八大类重要过敏原。 3.1.2 可视薄膜生物传感器芯片 optical thin-film biosensor chips 在平滑的基片表面均匀包覆一层100-1000纳米厚度的透明薄膜，并将捕获探针以矩阵的形式点样于活化的薄膜表面，即成为可视薄膜生物传感器芯片。在生物素标记的样品核酸与传感器芯片上捕获探针进行特异性反应之后，先后加入酶-抗体复合物和酶底物溶液。在酶的催化下，在芯片表面的探针点上原位沉积不溶物，引起薄膜表面厚度改变，继而导致探针点反射光的颜色改变，产生肉眼可见的杂交信号，完成样品检测。 缩略语 DNA：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸。 CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。 Tris：tris（hydroxymethyl）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 Taq：Thermus aquaticu，水生热栖菌。 OD：optical density，光密度值。 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链反应。 SSC：salt-sodium citrate，柠檬酸钠缓冲液。 ATC：acid-treated casein，酸处理的酪蛋白。 TMB：tetramethylbenzidine，四甲基联苯胺。 HRP：horseradish Peroxidase，辣根过氧化酶。 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T 27403-2008中附录D的规定。 方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用大豆Lectin基因、小麦Gliadin基因、花生Ara h 3基因、腰果Ana o 3基因、鱼16S rRNA基因、虾16S rRNA基因、牛线粒体DNA基因和鸡线粒体DNA基因设计和筛选特异性的引物和探针，基于食品过敏原多重PCR检测方法，进行可视薄膜生物传感器芯片高通量检测常见8种食品过敏原的方法，根据芯片杂交信号，判断样品中是否存在常见食品过敏原成分。 可视薄膜生物传感器芯片检测方法 原理 将醛基标记探针固定在经过氨基化处理的芯片表面，然后使用生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与芯片上的探针进行特定的杂交反应；接着用辣根过氧化酶抗体 （HRP-antibody）处理，然后洗去未杂交的DNA链，加入四甲基联苯胺（TMB）处理，这时生物素标记的杂交DNA链在HRP-antibody和TMB的作用下产生沉淀而形成一层有机薄膜，这层薄膜改变了芯片表面的厚度导致反射光的颜色变化，从而产生肉眼可见的信号，而没有杂交成功的探针位点，无法结合抗体则无变化。 仪器和设备 PCR仪。 离心机：最大离心力≥16 000 g。 微量移液器：2.