进出口动物源性食品中9种兽药残留量的蛋白芯片快速检测方法 意见稿.docVIP

前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。  最低抽样数，件 1~25 1 26~100 5 101~250 10 251~500 15 501~1000 17 1001~2500 20 3.3 抽样方法 按3.2规定的抽样件数，随机抽取，逐渐开启。每件至少取一袋作为原始样品。原始样品总量不少于2 kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。 3.4 试样制备 从每袋原始样品中取出部分代表性样品，充分绞碎混匀，加入清洁的容器内，加封后， 标明标记。 3.5 试样保存 样品应于-20℃冷冻保存。 注：在抽样和制样的过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 4 测定方法 4.1 测定原理 本方法根据抗原和抗体特异性结合的免疫学原理，采用荧光标记间接免疫竞争法测定样品的兽药残留含量。将兽药分子与载体蛋白进行偶联，固定在玻片上制备成蛋白芯片。芯片上固定的兽药能够与被检样品中的兽药竞相与兽药抗体结合。样品中兽药含量越高，结合的抗体就越多，则芯片上偶联兽药能结合的抗体就越少。通过洗涤除去溶液中未与芯片上偶联蛋白结合的兽药抗体、游离兽药及二者的结合物，然后加入荧光标记的二抗进行反应，再次洗涤后，通过芯片扫描仪扫描，荧光强度与待测样品浓度呈反比。 本方法用于出口商品中猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝和牛奶组织中磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、恩诺沙星、氯霉素、链霉素及双氢链霉素9种兽药残留量检测。其中对于磺胺间甲氧嘧啶和磺胺异噁唑的检测是通过这两种兽药与磺胺甲噁唑抗体的交叉反应来检测的，因此通过磺胺甲噁唑抗体所检测的是磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺异噁唑3种药物的总量；双氢链霉素是通过它与链霉素抗体的交叉反应来检测的，因此通过链霉素抗体所检测的是链霉素和双氢链霉素两种药物的总量。 4.2 试剂和材料 4.2.1 兽药残留蛋白芯片检测试剂盒 4.2.1.1到4.2.1.6中试剂和材料室温保存即可；4.2.1.7到4.2.1.13中试剂和材料需2~8℃ 贮藏，并且注意试剂使用时需恢复到室温（20～25℃）。 4.2.1.1 组织样品制备液A。 4.2.1.2 组织样品制备液B。 4.2.1.3 组织样品制备液C。 4.2.1.4 洗涤浓缩液。 4.2.1.5 混样管，单面胶。 4.2.1.6 盖片。 4.2.1.7 芯片，每张芯片可分析6份样品，盛于芯片清洗管中。 4.2.1.8 标准参照液。 4.2.1.9 一抗浓缩液。 4.2.1.10 二抗浓缩液。 4.2.1.11 抗体稀释液。 4.2.1.12 封闭液。 4.2.1.13 磁珠溶液。 4.2.2 去离子水。 4.2.3 洗涤缓冲液：按实验需要量由洗涤浓缩液（4.2.1.4）十倍稀释获得（20 mL洗涤浓缩液（4.2.1.4）＋180 mL去离子水/芯片）。 4.2.4 一抗工作液：按实验需要量由一抗浓缩液（4.2.1.9）十倍稀释获得（16 L一抗浓缩液（4.2.1.9）＋144 L抗体稀释液（4.2.1.11）/芯片）。 4.2.5 二抗工作液：按实验需要量由二抗浓缩液（4.2.1.10）十倍稀释获得（26 L二抗浓缩液（4.2.1.10）＋234 L抗体稀释液（4.2.1.11）/芯片）。 4.2.6 标准工作液的配制（6个浓度水平标准工作液/芯片）：分别取12 L一抗工作液和12 L标准参 照液（4.2.1.8）加至混样管（4.2.1.5）底, 将单面胶贴在混样管顶端，用漩涡混合器混匀。 4.3 仪器和设备 4.3.1 芯片扫描仪（含兽药残留判读软件）。 4.3.2 离心机，4000 rpm。 4.3.3 均质器。 4.3.4 分析天平：感量0.01 g。 4.3.5 恒温孵育器，37±1℃。 4.3.6 水浴锅。 4.3.7 漩涡混合器。 4.3.8 5000 (L，1000 (L，200 (L，20 (L移液器。 4.3.9 蛋白芯片反应盒。 4.3.10 摇床。 4.3.11 磁架，适用于1.5 mL离心管。 4.3.12 0.5 mL，1.5 mL，15 mL，50 mL 离心管。 4.4 测定步骤 4.4.1 样品提取 称取5.00 g均匀试样，至50 mL离心管内，对于鸡肉、猪肉、鸡肝和猪肝样本加入10.0 mL样品制备液A(4.2.1.1)；对于牛奶样品加入5.0mL样品制备液A(4.2.1.1)。在漩涡混合器上剧烈振荡2 min后80℃水浴20mi