实验2、显微镜油镜使用及简单染色法及细菌形态观察.docVIP

实验二、显微镜油镜的使用及简单染色法及细菌形态的观察 一、实验目的： 了解显微镜的结构及油浸镜的工作原理，学会正确地使用显微镜。掌握简单染色的方法和步骤，并用油浸镜观察细菌形态。 二、实验材料 普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、实验一所得的细菌菌落。 三、实验步骤： 1．普通光学显微镜的构造 显微镜是一种高度放大的光学仪器、它的种类很多，根据实验目的不同，可分别选用 普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜及电子显微镜。 在微生物一般形态的观察中，普通光学显微镜最为常用，它的主要构造包括机械（包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、粗调螺旋和细调螺旋、推进器、聚光器升降螺旋等部件）。和光学部分（又可分为照明和放大两个系统，前者包括反光镜、聚光器和虹彩光圈，还有特殊的光源部件；后者包括物镜和接目镜）两部分。 显微镜的总放大倍数等于物镜放大率和目镜放大率的乘积。但显微镜性能的优劣不只是视其放大倍数的高低，而更主要的是视其辨析细微结构的能力，即性能良好的显微镜必须使被观察的物体放大倍数高，而且清晰。 显微镜辨析细微结构的能力可用分辨率表示，其能够辨析的细微结构越小，则分辨率越高。分辨率的高低，首先取决于物镜的性能，若设物镜分辨出的物体两点间的最短距离为D，则 式中，λ为可见光的波长，平均为0.55μm；NA为物镜数值口径、镜口率或称开口率、。数值口径NA是物镜和被检标本间介质的折射率n与镜口角（即入射角a)的半数正弦的乘积。 由上可见，显微镜的分辨率与波长、介质折射率和镜口角（入射角）有关。λ越大，D值越大，分辨率越低；n和a越大，D值越小，分辨率越高。因此，可以通过缩短光线波长，增大介质折射率和加大镜口角（入射角）来提高分辨率。紫外光显微镜和电子显微镜就是利用短波光和电子波来提高分辨率的。但普通光学显微镜用的是可见光，波长一定，平均为0.55μm，而镜口角是指物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，理论上最大为1800，故sin（a /2）理论最大值为1（实际上镜口角度最大只能为1400），因此试图通过缩短波长或提高镜口角来提高光学显微镜的分辨率是有限度的。只有通过提高介质的折射率来提高数值口径，从而提高其分辨率。在使用低倍镜和高倍镜时，镜头与玻片标本间的介质是空气，其折射率是1，sin(a/2）＝sin700=0.94，故其数值口径NA＝1x0.94。使用油镜时，镜头与玻片标本间的介质是香柏油，香柏油的折射率为1.515，则其NA= 1.515 x 0.94，故油镜的数值口径总是大于低倍或高倍镜的数值口径，其数值口径最大可达到1.4，所以油镜的分辨率比低倍镜或高倍镜要高的多。例如，在可见光照射下，用数值口径1.25的油镜（一般油镜的镜口角半数的正弦为0.81），能分辨出物体两点间的最短距离D＝0.55/（2 x 1.25)＝0. 22μm而且数值口径为0.65的高倍镜，能分辨出的最短距离D=0.55/（2 x 0.65)=0.42μm 。即两点间的最小距离如果小于0.4μm，在高倍镜下即混为一点，不可辨晰，而在油镜下则清晰可见。 使用某一物镜时，应配合一定数值口径的聚光镜。一般以聚光镜的数值口径大于或等于物镜的数值口径为宜，否则影响物镜的性能。 由此可见，显微镜的性能不只是决定于总放大率。一般来说，显微镜的总放大率应以物镜数值口径的500--1000倍为宜，这个范围内的放大率叫有效放大率。 例如，用NA 1.25（100 x）的物镜，其有效放大率为1250，超过此数叫无效放大率，虽用15x的目镜可放大1500倍，但对分辨率是没有任何帮助的。 2．简单染色法 细菌个体微小，且较为透明。因此需借助染料使其着色，以便于在显微镜下观察。细菌简单染色是用一种染液一次着染菌体的方法。其原理是细菌在中性环境中一般带负电荷，所以当采用碱性染料进行染色时，这类染料解离后，染料离子带正电，故使菌体着色。具体步骤如下： 涂片：先滴一滴生理盐水于干净的载玻片上，然后按无菌操作方法用接种环勾取少许菌种与玻片上的水混合均匀，涂成一均匀的薄层。 干燥：将涂片于室温中自然干燥。 固定：待涂片干燥后，手持玻片，涂面向上，在酒精灯火焰上通过2-3次，以玻片放在手背上刚觉烫手为度。不能将玻片放在火上烤，否则细菌形态毁坏。固定的目的是，通过固定使细菌贴附在玻片上，并将细菌杀死，菌体蛋白变性，易着色。 染色：滴一滴结晶紫染液于菌膜上，染色一分钟左右，用清水在玻片上端轻轻冲洗掉染液，至冲洗水无色或浅色即可。注意不能直接冲洗染色部分，以免将菌体冲掉。 干燥：用吸水纸将染好的涂片吸干。 油镜观察：用油镜对涂片进行镜检，观察菌体形态、大小，同时绘出图来