SiRNA序列设计.docVIP

SiRNA序列的设计RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。1.1 siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。1.2 siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)， NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。以AAN19 标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中70%～80%可产生RNAi 作用。但是一些具有较小脱靶效应的siRNA序列不是以AA为起始的，所以现在不推荐以“AA为起始”作为选择标准之一[6]。最新研究表明[7,8] ，27 nt或29 nt的siRNA与21 nt siRNA相比：（1）其抑制活性可提高数倍以上；（2）不易于诱导干扰素反应和激活PKR；（3）一些基因对21 nt siRNA不敏感，但是可以被27 nt siRNA有效的抑制；（4）与21 nt SiRNA相比，27 nt SiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。另外，在选择siRNA 序列时，要考虑到所用启动子的类型。U6启动子要求转录产物的第一个碱基是G，正反义链均如此；H1启动子转录产物的第一位碱基为U、G、C均不影响基因的沉默效果[9]。1.3 siRNA 3′端突出碱基的选择当siRNA 的3′端突出碱基为UU时，其基因抑制效率最高；但是3′端的突出碱基不能为G，因为RNase会降解以G为末尾的RNA 单链。Elbashir等［2］建议用dTdT取代3′端的2 个碱基突出，增强siRNA 双链复合体的稳定性。需要注意的是，由于双链siRNA中的正义链不参与对靶mRNA的识别，所以正义链的3′端突出碱基可以用dTdT替代，但是反义链3′端突出碱基必需与靶mRNA序列相同的。1.4 siRNA序列中G/ C含量的选择在siRNA 序列中，G/C 含量的选择比确定以AA 为起始的序列更重要。具有均衡碱基含量(即G/C含量在30%～70% ) 的序列可以作为siRNA候选序列；而具有较低G/C含量（30%～52%）的siRNA序列，其沉默基因效果较好[10]。1.5 siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列[10,11]因为连续2个以上的G和C可以降低双链RNA 的内在稳定性，从而抑制RNAi作用[12]；连续3个以上的U和A可能终止由RNA Polymerase III介导的转录[13]。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低siRNA的有效浓度和沉默效率。1.6 siRNA双链的内在稳定性siRNA反义链5’端具有较低的热稳定性，即反义链5’端的第一个碱基为A或U；siRNA正义链的5’端第一个碱基为G或C。因为siRNA解旋可能从富含A/U的反义链5’端有效的起始，有利于反义链与RISC的结合，而抑制正义链与RISC的结合[14]。1.7 siRNA正义链的碱基偏爱性以3’端具有2 个碱基突出的19 nt siRNA为例，正义链的第一位和第十九位碱基为A；正义链的第十位碱基为U；正义链的第十三位碱基不为G；正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA 序列具有较高的基因沉默效率[10]。1.8 siRNA 序列的特异性为了确保侯选siRNA 序列只沉默单一的靶基因, 侯选siRNA 序列应在美国NCBI (National Center for Biotechnolo