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烤烟叶微生物产酶β－淀粉酶，糖化酶，果胶酶，CMC酶，蛋白酶）的产生与温度稳定性。结果表明，2％烟叶水为基本培养基，适当添加少量诱导物（0.2%），对于碳水化合物类生物大分子降解酶类的产生具有一定的诱导作用。60度保温时，反应温度越高，酶活越高；相同反应温度时，保温温度越高，酶活越高. 60度下，酶易失活。
关键词 烟叶 醇化 诱导物 酶稳定性
烤烟醇化（陈化）需要2－3年，这期间的反应主要由于酶的作用，化学作用和微生物作用【1】. 微生物产酶应用于烟叶陈化，一可以缩短烟叶醇化的周期，二可以提高烟叶的内在品质. 人们研究认为纤维素，果胶，淀粉，蛋白质的含量在一定范围内与烟叶的质量呈负相关【2】. 目前国内已见报道利用成品酶改变烟叶的化学成分，提高烟叶质量【2，3，4】. 还有研究报道了陈化期间烤烟叶面微生物的变化趋势【5，6】.
我们已经连续2年对陈化期间的烟叶取样，进行了烟叶微生物菌种分离，纯化，鉴定及优势微生物菌株所产的酶类鉴定. 我们现有的结果说明，存储烟叶表面存在大量的微生物，细菌，霉菌，酵母菌均有不同程度存在. 我们的目的是利用复合微生物，复合微生物酶对烟草进行人工醇化. 本文研究了几株微生物降解酶类的产生及其酶的稳定性，为人工醇化烟草奠定了理论基础.
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株：连续两年取陈化期间的烟叶，筛选微生物，普测β－淀粉酶，糖化酶，果胶酶，CMC酶，蛋白酶的活性. 选出产酶活性高的菌株.
1.1.2 烟叶：山东B2F，取自济南将军集团储藏库
1.2仪器: UNICO UV-2000 全波段分光光度计
1.3 实验方法
1.3.1培养方法：
非诱导培养：用1％烟叶抽提物配制牛肉膏蛋白胨培养基１５ｍｌ接种摇床培养８－１０ｈｒ，转接到２％烟叶水100ｍｌ三角瓶中，摇床继续培养２４ｈｒ
诱导培养：用加有0.2％ 诱导物的1％ 烟叶抽提物配制牛肉膏蛋白胨培养基１５ｍｌ接种摇床培养８－１０ｈｒ，转接到加有0.2％ 诱导物的２％烟叶水１００ｍｌ三角瓶中，摇床继续培养２４ｈｒ． 测定淀粉酶，糖化酶，果胶酶，CMC酶，蛋白酶时的诱导物分别为可溶性淀粉，可溶性淀粉，果胶，CMC, 酪蛋白。
1.3.2 酶活测定方法：
1.3.2.1 β-淀粉酶：培养液8000－10000rpm5min，取适当离心发酵液1ml，25度放置；乙酸缓冲液（pH＝4.8）制备的1％可溶性淀粉1ml,25度放置。将两者混合于25度酶解3分钟，加入1.5mlDNS,沸水浴6min，稀释反应液至25ml，振荡混匀在540nm下测定光吸收，平行3管。空白样品用灭活10min的发酵液. 以每1ml酶液每min生成1微mol麦芽糖作为一个酶活单位.（标准曲线用2mg/mol的麦芽糖）
1.3.2.2糖化酶：用1%可溶性淀粉溶液作底物. 将1ml酶液与1ml底物溶液在50℃水浴调温，待温度平衡后混匀反应10min，加入1.5mlDNS，沸水浴加热5min. 自来水冷却后蒸馏水补充到25ml,在540nm处比色测定. 空白对照用灭活酶液. 以每1ml酶液每小时生成１０ｍｇ还原糖作为一个酶活单位.
1.3.2.3 CMC酶：CMC溶液，羧甲基纤维素钠用pH=4.8的0.1M的醋酸缓冲液配成1％的溶液.测定时加入1.5ml再加入500μl酶液摇匀，50℃保温30min，加入1.5mlDNS，煮沸6min，补充蒸馏水至25ml，用550nm分光光度计测定. 空白对照用灭活酶液. 通过葡萄糖标准曲线，以每1ml酶液min生成1微mol葡萄糖作为一个酶活单位.
1.3.2.4 果胶酶：0.2ml酶液+0.6ml 0.2mol/L pH4.2的 HAc－NaAc缓冲液＋0.2ml 1％底物（果胶），混匀，50度水浴保温30min，取出，冷水浴中止反应，加入1ml Somogyi 甲液，放入沸水浴中煮沸10min，加入1.0ml Somogyi乙液，定容至10ml. 于560nm处比色.
对照：酶和缓冲液，底物同时保温30min，之后混合. 以每1ml酶液每min生成1微mol半乳糖醛酸作为一个酶活单位.（标准曲线用0.5mg/ml 的半乳糖醛酸）
1.3.2.5 蛋白酶：取5ml酪蛋白溶液加入试管中,在37℃水浴上平衡5min，加入0.1ml酶液.在37℃水浴上振荡培养10min，加三氯乙酸溶液终止反应，静置15min，用Whatman No.42滤纸过滤. 在波长280nm处测定光吸收（1cm）光径。空白对照：在底物溶液中先加三氯乙酸，再加酶液，其余步骤同上.
在上述条件下，每1ml酶液每分钟A280nm产生0.001变化所需要的酶量定义为一个酶活单位.
（A-Al） *10
想对活性＝ 0.
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