实验1动物组织总RNA的制备及检测.docVIP

实验1 动物组织/细胞总RNA的制备及检测 实验目的： 使学生掌握采用Trizol抽提法从动物新鲜组织或细胞制备总RNA的实验技术，以及用紫外分光光度法检测RNA的纯度及定量、用琼脂糖电泳法检测RNA的完整性及质量。 实验原理： Trizol是一种新型的总RNA即用型制备试剂，适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。Trizol?试剂是由苯酚和异硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。 Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。但酚虽可有效的变性蛋白质，却不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。0.1%的8-羟基喹啉与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。Trizol可以抽提长达15 kb的RNA，也可以抽提microRNA等小RNA。抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、分离mRNA、RNase保护分析、体外翻译、cDNA克隆、基因表达芯片分析、高通量测序等。 紫外吸收法测定核酸含量的原理：DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用κ（P）260nm来表示，κ（P）260nm为每升溶液中含有1摩尔核酸磷的光吸收值。RNA的κ（P）260nm （pH7）为7700~7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每ml溶液含1μg RNA的光吸收值相当于0.022~0.024。小牛胸腺DNA钠盐的κ（P）260nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每ml溶液含1μg DNA的钠盐光吸收值为0.020。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 RNA浓度（μg/ml）= A260nm ×稀释倍数 0.024×L DNA浓度（μg/ml）= A260nm ×稀释倍数 0.020×L 式中： A260nm为260nm波长处光吸收读数；L为比色池的厚度，一般为1或0.5cm；0.024为每ml溶液内含1 g RNA的光吸收；0.020为每ml溶液内含1 g DNA钠盐时的光吸收值。