出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法 编制说明.doc

《出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法》编制说明 一、任务来源 出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法2011B141。 二、编制依据 本标准是按照GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》（以下简称《基本规定》）的要求编写的。 、研究背景 是截短侧耳素类的衍生物，属于双萜类半合成抗生素用于治疗畜禽的感染性疾病，尤其是对猪痢疾、猪腹泻及霉形体肺炎具有优异的治疗及预防效果和结肠炎的危险g/kg，沃尼妙林为50μg/kg，肝脏中都为500μg/kg；日本农林渔业部(MAFF)对动物肝脏、脂肪、肌肉组织中沃尼妙林和泰妙菌素的最高残留限量为0.04-6 mg/kg。 我国是畜禽饲养、生产、消费和贸易大国，畜禽肉出口市场主要集中在日本、韩国和欧盟等。但是我国肉类在出口时常发生因药物残留超标而被国外拒接进口的事件。另外日本06年提出了肯定列表制度，其制度大幅提高了进口农产品、食品的准入门槛。因此为了有效控制泰妙菌素和沃尼妙林的安全使用，保障产品的食用安全及打破国外技术壁垒，保障产品的顺利出口，有必要建立动物源性食品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量的检测标准及方法。 目前有关这两种抗生素检测技术主要有气相色谱法 (GC)[10] 、高效液相色谱法(HPLC)[11-14]和高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)法[15-23]。GC法需要衍生化，操作复杂，耗时耗力；HPLC对复杂基质的动物性食品中抗生素多残留检测的灵敏度和准确可靠性较低。高效液相色谱-串联质谱联用技术(HPLC-MS/MS)以其操作简便、准确度和灵敏度高、选择性强等优点成为各种兽药残留的确证方法，因此本文采用高效液相色谱-串联质谱法对肉中泰妙菌素和沃尼妙林的残留量进行同时检测，考察了前处理条件和仪器测定参数，并对各影响因素进行了较为深入的探讨, 旨在建立一种高效快捷可靠的方法来同时检测肉中这两种抗生素。因此本标准采用固相萃取技术对样品净化，电喷雾离子化，(LC-MS/MS)检测，外标法定量沃尼妙林及其同系物泰妙菌素检出限为.0 μg /kg。出口动物源性食品色谱柱分离以电喷雾离子源在正离子多反应监测(MRM)模式下进行测定 五、 5.1样品前处理条件的选择 5.1.1　提取条件的选择 根据文献报道[16-19]，分别使用三氯乙酸-水（1+19，W:V）、乙酸乙酯和乙腈作为提取液，比较提取效果，结果表明,乙腈的提取效果较好，并且提取杂质少，可有效的避免了基质干扰。 5.1.2 净化条件的选择 样品提取过程中的基质杂质可显著的抑制离子化效率，从而造成仪器灵敏度的降低。本实验采用乙腈提取只能去除部分油脂和水溶性杂质，如未经SPE 小柱净化则会在质谱上产生较强的基质效应。Oasis MCX SPE 柱是一种新型的混合型强阳离子交换、水可浸润性聚合物吸附剂，对碱性化合物具有高度的选择性和灵敏度。 本实验待测物侧链含有氨基和酰胺基，属弱碱性化合物，经5 %甲酸水溶液酸化后以离子化的形式锁定在强阳离子交换点，除去基质中的蛋白质和盐类，再用纯甲醇和正己烷洗脱除去酸性及中性干扰物，最后用5 %氨水甲醇溶液洗脱目标碱性分析物，保留疏水碱性干扰物，从而获得最佳的净化效果和回收率。并且通过实验对比了MCX(150mg，6mL)和MCX(60mg，3mL)两种固相萃取柱的净化效果，结果表明用MCX(60mg，3mL)固相萃取柱得到的回收率较高。 5.2 测定条件的选择Acquity BEH C18 UPLC 色谱柱，填料粒径为1.7μm ，与常规液相色谱柱相比，具有更高的灵敏度、更强的分离能力和更短的分析时间，可以使待测物组分在较短的时间内实现最大程度的有效分离。分别考察了使用不同洗脱梯度分离沃尼妙林和泰妙菌素的效果，实验结果发现降低流动相中乙腈的比例可以将二者有效分离，但同时也会导致灵敏度降低，最终选择表1所示的梯度洗脱程序，得到较为满意的分离度和灵敏度。为了进一步提高二者在正离子模式下的灵敏度和分离度，又分别研究了在流动相中添加甲酸体积分数为0.05 %、0.1 %、0.2 %、0.5 %时，色谱图的灵敏度和分离度，结果表明添加0.1 %甲酸水溶液的情况下待测物组分分离效果和灵敏度最好。 图1为优化条件下，沃尼妙林和泰妙菌素的选择离子流图，其总保留时间为 4.22min。沃尼妙林和泰妙菌素的保留时间分别为2. 09、1. 98 min , 分离效果良好, 分析时间为4 min。 最终选择液相色谱参数： 色谱柱：柱，mm×2.1 mm，μm）；流速：L/min；进样