E.coli DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究.pdfVIP

· 短篇论著 · 2012年1月第9卷第1期 E．coliDH10B碱性磷酸酶基因的 克隆、表达及活性研究 李 军 ，黄 霞2姚雪梅 ，陈雪芬 ，齐兴柱 1．热带生物资源教育部重点实验室 ，海南海 口 570228；2．海南大学海洋学院，海南海El 570228 摘【要】目的：克隆并表达E．coliDH10B碱性磷酸酶 (AKP)成熟肽基 因(phoAm)，为 AKP的定 向改构及应用奠定基 础 。方法 ：采用 PCR法从 E．coliDH10B基因组扩增 phoAm；将 phoAm克隆入表达载体pET28a，再转入E．coliBL21 (DE3)进行表达 ；用免疫金层析法和 SDS—PAGE法检测表达的重组rAKP；采用对硝基酚磷酸(pNPP)法测定rAKP 的活性 。结果 ：rAKP单体分子量约47K，活性分析比对照菌提高 21．5倍。结论：获得 AKP成熟肽基因并得了到具有 较高活性的重组 rAKP。 关【键词】碱性磷酸酶 ；大肠杆菌DH10B；表达纯化 ；活性分析 中【图分类号】Q78 文【献标识码】A 文【章编号】1673—7210(2012)01(a)一028—03 Studyon cloning，expression and activity ofalkalinephosphatasefrom Es- cherichiaCOliDH10B LIJun2‘，HUANGXi YA0Xuemeie,CHEN u n QIXingzhu。 1．KeyLaboratoryofTropicalBiologicalResourcesofMinistry ofEducation，HainanProvince．Haikou 570228。China； 2．OceanCollegeofHainanUniversity，HainanProvince，Haikou 570228，China A【bstract】0bjective：TocloneandexpressalkalinephosphatasematurepeptidegeneofE．coliDH10Bfortheofundation ofdirectedstructuraltransformationandapplicationofAKP．M ethods：phoAm genewasamplifiedfrom EcoliDH10B genomebyPCR；phoAmgenewasclonedintopET28aandtransformedintoEcoliBL21fDE3)；rAKPwasdetectedbyim— muno—goldchromatographyandSDS—PAGE；theactivityofrAKP wasdeterminedbypNPP method．Results：Molecular weightofrAKPmonomerwasabout47K．andactivityofrAKPincreased21．5timescomparedwiththecontro1．Conclu． sion：AKPmaturalpeptidegeneandrAKPwithhigheractivityisacquired． K【eywords】Alkalinephosphatase；E．coliDH10B；Expressandpurify；Activityanalysis 碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase，AKP)是一类非特异性 E．coliDH5ot及原核表达载体 pET28a(+)由热带生物 资源教 磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯 的水解[1】。AKP广泛存在于多 育部重点实验室保存。 种细菌 、真菌和动物中。不同来源的AKP的相对分子质量和 1．1．2试剂 T4DNA连接酶 、限制性核酸 内切酶 BamH I、 编码序列差异很大 ，且各种AKP的性质 、结构 、功能和催化 Hindm、氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫