公猪精液DNA提取与检测方法的优化设计（.docVIP

公猪精液DNA提取与检测方法的优化设计( 刘向东 向安静 程文科 彭中镇 赵书红(( （农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，华中农业大学农业，武汉，430070） 摘 要：笔者对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。经过对比实验，我们最终确定了最优处理，分述如下：使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取DNA能够取得更好的效果；在本研究采用的1.5ml提取体系中加入50～100ul的精子沉淀，利用PK终浓度至200ug/ml消化6～12h，随后采用氯仿抽提1次，其余步骤按文中通用步骤所述，就可以获得高质量的基因组DNA。同时本研究也确定了低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为0.8%，电压为80V/20cM，DNA上样量为2ug，电泳至少30min。 关键词：猪 精液 DNA提取 DNA检测 优化 基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容之一。猪是我国重要的动物性蛋白来源。在实际育种生产和科学研究过程中，我们通常需要大量高质量的公猪基因组DNA来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些DNA是从动物的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。对于公猪而言，公猪的精液是相对于其他组织更容易获得的，所以利用精液来提取公猪DNA是更有效的方法。但国内目前尚没有最优化的公猪精液基因组DNA提取方案的报道。 提取动物基因组DNA的方法种类繁多，目前主要分成两种，一是试剂盒法，二是经典的酚仿抽提法。试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是价格昂贵，有的产品DNA产率较低。酚仿抽提法虽然操作略微繁琐，但总的来讲价格便宜，而且能够获得高质量的基因组DNA，所以目前应用十分广泛。在利用酚仿抽提法提取基因组DNA的过程中，每一个环节均可影响实验的结果，其中初始样品类型、初始样品量、PK剂量与消化时间和酚抽提次数是重要的影响因素。因此，笔者基于经典的酚仿抽提法对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取和检测高质量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。 1材料 1.1 试剂 生理盐水、蛋白酶K（20mg/ml）、氯仿/异戊醇（24:1）/异戊醇（24:1）3M NaAC、10×TE Buffer（pH8.0）、5×精子提取液 10ml，混合均匀，高压灭菌，室温保存。 1.2 仪器和耗材 仪器设备：滴管、小烧杯；10ul、200ul、1000ul微量移液器；高速冷冻离心机10min，4℃，12000rpm离心7min，转移上清（500ul左右）至另一离心管；然后再重复一次；用等体积苯酚/氯仿/异戊醇（2524:1）氯仿/异戊醇（241）1/10体积的3M NaAC（≈50ul）及2.5倍体积的无水乙醇（≈1.3ml，-20℃预冷）（可选：-20℃，2h）轻轻翻转转动至DNA聚集成团，4℃，10000rpm离心2min，离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体；加入75%乙醇（-20℃预冷），让DNA沉淀悬浮于溶液10min，4℃，12000rpm离心2min，离心后倒掉残留液体，再重复洗涤两次； 4℃，12000rpm离心2min，离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体，将DNA自然晾干后，加入100ul TE溶解（可选：37℃助溶1h），检测和稀释分装完毕后于-20℃或-70℃长期保存，原液避免反复冻融，稀释液可储于4℃待用。 2.3.2 DNA定性检测即检测DNA片段大小及完整性 制备0.8％ 琼脂糖凝胶；吸取2ul DNA原液，与3ul双蒸水混合稀释，加入1ul上样缓冲液。80V/cm恒压电泳10～100min，同时以大片段Marker作为标记对照物；电泳完毕，置于凝胶成像系统中观测DNA片段大小和亮度及是否存在降解情况； PCR检测：基因为INOS，扩增子长度为390bp，其余均为PCR常规体系和条件。 3 结果和分析 3.1 不同因素对DNA提取效果的影响 3.1.1 初始样品类型（精清和精子）的提取效果 图1初始样品类型对DNA品质的影响 Fig1 The effect of sample types upon DNA quality 泳道1、2、3为200ul精子沉淀的提取结果，泳道4、5、6为200ul精清的提取结果；如上图所示，使用自然分层的精液中的精子沉淀提取DNA，待其盐醇沉淀后可以看到DNA沉淀，而使用精清的则无明显沉淀。由此可见，使用精液自然沉淀后的下层精子沉淀比直接使用精清的效果要好。 3.1.2 初始样品量对提取效果的