灵孢多糖对MPP+ 损伤PC12细胞的保护作用.DOCVIP

临床医学论文-灵孢多糖对MPP+ 损伤PC12细胞的保护作用 ?????????????? 作者：杨海华, 李毅， 张丹桃， 徐评议， 刘焯霖, 朱雯， 骆飞飞 【摘要】? 【目的】 观察灵孢多糖(GLPS)对甲基-苯基-吡啶离子（MPP+）诱导损伤的PC12细胞的保护作用。【方法】 将MPP+ 或GLPS加入体外培养的PC12细胞中，建立多巴胺能神经元损伤模型，用四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞活力的变化；以乳酸脱氢酶（LDH）检测法检测培养上清液中LDH水平的改变；通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学法检测TH阳性细胞数及蛋白的表达。【结果】 MPP+处理48 h后，细胞活力降至对照组的52％，经GLPS（100、200、300 ?滋g/mL）预处理后，细胞活力明显提高，分别为65％，75％，79％（P0.05）。MPP+处理48 h后，上清液中LDH水平较对照组明显提高，经不同浓度的GLPS预处理后，上清中LDH水平有所下降 (P 0.05)，且TH阳性细胞数及表达强度明显高于MPP+ 组。【结论】 灵孢多糖对MPP+ 诱导损伤的PC12细胞具有保护作用。 【关键词】? 灵孢多糖； PC12细胞； 帕金森病； 1-甲基-4苯基吡啶离子 帕金森病（Parkinson disease, PD）是一种好发于中老年的慢性神经系统退变性疾病，其发病机制目前尚不清楚。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）通过在体内代谢为1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+）的形式而对多巴胺能神经元产生毒性作用［１］。大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12株具有多巴胺能神经元的特点，被广泛用来建立PD细胞模型。近来，本实验室研究发现，灵芝孢子粉对PD大鼠模型中的多巴胺能神经元及离体原代多巴胺能神经元均有一定的保护作用[２,３]，但其有效成份及相关机制尚不清楚。灵孢多糖是灵芝孢子粉中的主要药效成分之一，具有抗炎、抗氧化等广泛的药理活性[４]。因此探讨灵孢多糖在多巴胺能神经元保护方面的作用对PD发病机制的认识及寻找新的治疗途径有重要意义。目前灵孢多糖对MPP+ 所引起的PC12的损伤是否具有保护作用，尚未见有文献报道。 ??? 1?? 材料与方法 ??? 1.1?? 药物与试剂 ??? MPP+（Sigma, USA），灵孢多糖（北京协和制药），RPMI-1640培养基（GibcoBRL）,兔抗大鼠酪氨酸羟化酶多克隆抗体 (Tyrosine hydroxylase, TH,CHEMICON )，荧光二抗FITC（DAKO公司），MTT（博理公司），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（南京建成），Hepes（Gibco），新生牛血清（杭州四季青），马血清（Gibco）。 ??? 1.2?? 细胞及培养 ??? 细胞培养液为RPMI-1640，内含100 mL/L 新生牛血清、50 mL/L马血清，青霉素100 IU/mL, 链霉素100 ?滋g/mL, Hepes 0.01 mol/L,在37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养。细胞汇集至85% 时进行传代接种。选取对数生长期细胞进行实验。 ??? 1.3?? 分组与处理 ??? ①空白对照组(control),在细胞培养体系中不加入任何药物; ②单纯GLPS处理组,在细胞培养体系中加入300 ?滋g/mL GLPS;③MPP+处理组,在细胞培养体系中加入MPP+;④GLPS+MPP+处理组,在细胞培养体系中加入GLPS预处理30 min，再加入MPP＋ 继续处理48 h,GLPS终浓度分别为100 ?滋g/mL、200 ?滋g/mL、300 ?滋g/mL。 ??? 1.4?? MTT法测定细胞活力 ??? 细胞接种于96 孔板,接种密度是1 × 105/mL,体积是200 μL/孔,每组细胞接种于8个孔中。细胞处理48 h后,收取上清，再加入培养基180 μL，每孔再加入MTT 20 μL,继续培养4 h,然后吸出培养液,加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL,振荡10 min,在酶联免疫检测仪上于570 nm波长处读取标本的吸光度,各组的吸光度与对照组的吸光度比值作为细胞的活力。每个时间点各重复上述实验一次。 ??? 1.5?? LDH水平检测 ??? 用收取的96孔板中的上清进行LDH水平检测。按照试剂盒说明书进行操作。取上清液20 μL，加入基质缓冲液250 μL及辅酶溶液50 μL，混匀，37 ℃水浴15 min。加入2,4─二硝基苯肼溶液250 μL，混匀，37 ℃水浴15 min。再加0.4 m