铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因克隆及在昆虫细胞中表达研究.pdfVIP

摘要 弹性蟹白簿(elastase)是一种{i王分解不溶性弹性鬣自为特征的广谱款链内切酶，广泛 存在予哺乳动耢及A的各种组织和俸渍巾。弹性蟹白酶不仅能水解弹性蛋白，而且也可以 承解箕链蛋鑫袤，翔孵皎，盘簸蛋爵、爵蛋裔、盘纤壤蛋自簿。蠲此广泛疲用于医疗卫生、 食晶麴王、霹用纯工及环境治理等行控，其商较大辩绞漭价值稽应搿前景。爵前萄内主要 致猪壤驻申提取，由子酶滚受到限制，律为漕疗掰生纯药物帮其它方蔼的应鞠长期供不应 求。 嚣，}毒关弹性蛋彝酶敷研窕起步较鼙，并且耪步建立7娃徽生耱发酵方式生产撵能蛋 自酶的工业技术体系。但是微生物发酵割鍪熬弹性蛋叁酶东生锈安垒性和毒性试验土酃还 不能令人满意。因此。作为演疗药鳓震的弹性蛋岛酶仍然感疆予扶生镑黢器孛提取。鉴予 以上原圆，本研究利用基爨工糗技术。竟隆了弹性蛋白酶基因，遗过抒状褒毒袭这裴钵募 统在昆煦细胞sf21中对其进行裹核表达，初步撵索出一豢以壤葵细胞剿鍪弹性蛋皇浆豹赣 路子。之所以采朋杆状病毒表逖载体系绒，悬因为它具褒藏躲生甥安全性，熙姆拭瘸毒裹 达载体系统生产的重组蛋白已获得包括美国FDA在内的广泛认可。此外，宦在重组虽白褒 达薰和维持表达产物的天然生物活性方面具膏较商的水平。是一种应用广泛的真核袭达娥 体系统。 本研究以一产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板。经PCR扩增得到l，5kb 的弹性鬻白酶基瑚，测序后与GeneBank中的钢绿假单胞菌序列比对发现同源性100％。然 后对PCR产物进行T-A克隧，获得质粒pMDIS-EIa。将弹性蛋白酶基因切下，转入剿载体 尉一超将弹往蛋自酶蒸嗣克陵蓟秆狄痛毒裘运载体系统的pBacPAK8转移栽体．构建了蘸 载摔pBacPAK8，GFP。焉BamH 臻甥验谖，发现弹性虽自酶及主游6XHis枣莼正确插入蓟秆捷病毒多角休启动子下。 果躅鼹豢体奔导竣，将两个转移簸伴秘亲本病毒一粒菸转染琵虫鲴脆系sf2l，72小时 蓐谯荧巍显徽镶下观襄到怼爨蜜验维靛绥蕤茇女螅荧光，供试棒赫组静缀施也鬏生了矮疆 的NPV感絷痉：蚨_；豫痍变。鄹牧缨熬壤葵±溪，空斑缝纯获褥7黧缢瘸毒BacPAK-EIa及 基秘细胞层遴行以下试验：提取感毒缨臆DNA修建模擞，黠弹性蛋鑫酶基因cDNA迸撑 PCR扩增，能够褥到1．5kb条带；提取感攥细胞总蛋皇遴簿SDS-靶AG嚣实毅，霹鞋发现与 弹性蛋白酶(33KDa)犬小相近的34KDa条带。以弹性凝皇热底物鳃平援承解爽验，发溪 感毒细胞裂解液能够水解其专一底物弹性摄自，证实了辨源基因产物翼窍～建的生甥活性。 以地农红-弹性蛋白为底物，通过和攻毒后不同时间的细胞裂解渡避行农解反应测定夔滔， 得到了表达产物的最大酶活力为21u／ml。 通过对表达产物的酶学特性分析发现，外源弹性蛋白酶的晨适作用pn值为9．5，在 7．0．8．5的范围内稳定，最适作用温度为37(2，温度高于37(3时，酶活急剧下降，当温度 达到50C以上，酶几乎完全失活。弹性蛋白酶耐热性实验发现，在37℃下．酶的活力保持 不变．当温度高于37C，酶活力开始有较小损失，当温度高于50℃，酶活急剧下降，当温 度达到60C以上，酶活性几乎完全丧失。 关键词：弹性蛋白酶； 杆状病毒； 表达； 昆虫细胞 ll ^BS聪^CT 曼寰皇曼—■冀审皇■墨■■量—■攀矗I nil I}11 II ABSTRACT Elasiaseisoneofthe withthe extendod-spectmmeodopeptidasespro】喇移ofhydrolyzing in tissuesand fluidofmammaliansandhuman． insoluble exisis elastin，andexteddly many body Not theetastmcanbe alsodo other suchas only byelastasC,but