钙钙调蛋白依赖性激酶II在血管紧张素II受体1型活化和信号传递中作用研究.pdf

lIIII I III rllIIII III IIl ＼1971322 目 录 摘 要 OBO……………………………………………………………1 中文摘要……OOO ● OOB 英文摘要…OOOOOO……………………………………………………………3 中英文对照表…………………………………………………………………6 弓l 言”····………·”…···……···”·”··········一“””一……”……”…”¨8 正 文CaMKII在AT。活化和信号传递中的作用研究 第一部分建立表达AT。和CaMKII／DN的转染COS，细胞模型………………10 第二部分测定双转染后表达的AT。和CaMKII／DN的功能…………………19 第三部分CaMKII／DN和AT，是否结合?………………………………………25 第四部分AT。和CaMKII／DN在细胞内相对分布情况…………………………31 综 述…···”·”·”····”·”·”·”··””……··………””一”””””．．”…”””37 ● 参考文献………………………………………………………………………44 后 记·””··”···…”·”·”·”·……“”””一…”””…”””””一”¨．．¨¨．．¨47 中 文 摘 要 CaMKII在AT。活化和信号传递中的作用研究 血管紧张素II(Angll)是重要的致心肌肥厚因子，它可以引起心脏的变时、 变力效应及引起细胞增殖等n3，这些作用大部分都是由Angll受体1型(AT。)来 介导完成的。 钙／钙调蛋白依赖性激酶(CaMK)是细胞内重要的钙调节蛋白，心脏中主要 表达的异构体为CaMKII。有研究发现在肥大心肌和衰竭心脏中，CaMKII的表达 也是升高的口1。那么，CaMKII是否存在于AnglI—AT。信号通路上? 我们通过一系列的实验证实，在经转染质粒表达AT．和CaMKII的COS。细胞 种结合无明显影响。而CaMKII的无功能突变体DN不能传递Angll信号。提示 CaMKII引起心肌肥大的作用与AngII经AT．传递的信号通路只是部分相关，而主 要是通过其他未知的信号通路。 总实验分为四个部分： 第一部分建立表达AT。和CaMKII／DN的转染COS，细胞 ● 选及试剂盒抽提得到相关质粒，经EcoRl+NotI内切酶双消化鉴定AT。，得到目的 1．8kb左右长度目的CaMKII／DN质粒片段，表明扩增成功。通过磷酸盐钙沉淀法 将不同质粒组合转入COS，细胞内。分别提取转染细胞中的胞膜蛋白及胞浆蛋白， 免疫荧光法(IF)可测得细胞表达AT。／姒、CaMKII／DN／V。，而未转染细胞中未能 测得相应蛋白，表明质粒成功转入COS，细胞内。结论：转染细胞模型成功建立。 第二部分测定双转染后表达的AT。+CaMKII／DN对AnglI的p-ERK反应性 ● 个明显的P—ERK活性抑制峰，经给予ARB预处理后这种作用消失；单转染细胞中， 转染AT。组出现p-ERK活性升高并可被ARB消除的现象，阴性对照组、转染CaMKII 号， DN及单纯CaMKII不能传递AnglI的肥厚信号。 情况 给予转染AT。+CaMKII／DN的细胞