谭清苏铁性别相关RAPD和SCAR标记研究.pdfVIP

摘 要 苏铁类植物是地球上现存的最原始种子植物之一，有“活化石”的美称。苏铁类植物为 雌雄异株，开花较晚，在性成熟之前雌雄植株在形态上无法区分，对于就地保护的野生 种群，很难确定种群的性别结构，迁地保护工作也需要知道植株的性别，按照一定的性 别比例交叉种植。谭清苏铁(Cycas tanqingii D. Y. Wang) 是1996 年发表的一个新种，分布 于我国云南南部、越南等地区。由于自然环境影响和人为破坏原因，谭清苏铁濒临灭绝。 因此，在性成熟之前或性别未知时鉴别植株性别对于就地保护和迁地保护中谭清苏铁雌 雄植株的定向繁育、增加种群数量都具有重要意义。 本研究利用随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)和特 征序列扩增区域 （Sequence Characterized Amplified Regions ，SCAR）分子标记技术筛选 与谭清苏铁性别高度相关的标记，为谭清苏铁的早期性别鉴定提供技术支持，可用于谭 清苏铁的就地保护和迁地保护，实验中的性别标记DNA 序列可用于苏铁类植物的种系发 生研究。 采用单因子实验结合正交实验分析方法优化了苏铁类植物基因组 DNA 的提取方法 -CTAB 法（十六烷基三甲基溴化铵），该方法能够用于二十种苏铁类植物基因组DNA 的 提取。提取的 DNA 溶液用电泳法检测不到 RNA、蛋白、多糖等杂质。紫外分光光度计 测其吸光值，OD260/OD280 值在 1.8～2.0 ，浓度0.17～0.54mg/ml，提取率可达0.62%，能 够满足PCR 扩增和酶切等分子生物学实验。 从 160 个随机引物中筛选出引物 S465 （CCCCGGTAAC ）能够扩增出 1 个与谭清苏 铁雌株性别相关的特异RAPD 分子标记RTQC-S465-500 。最后将其成功转化为特异性更 强的SCAR 性别相关标记STQC-S465-483 。该SCAR 标记有483bp 大小，能够稳定地在 谭清苏铁雌株基因组DNA 上扩增出特异片段，而在雄株基因组DNA 上没有扩增。因此 STQC-S465-483 标记可用于谭清苏铁的性别鉴别。 该特异引物对其它苏铁类植物基因组DNA 进行扩增，有的未能扩增出任何片段，有 的雌雄植株扩增片段一样，有的雌雄植株扩增片段有差异，也可以用于这些苏铁类植物 的雌雄植株性别特异分子标记的建立和雌雄植株的性别鉴定。 关键词：谭清苏铁；分子标记；植物性别；雌雄鉴定；RAPD；SCAR I ABSTRACT Cycads are one of the most ancient lineages of seed plants. Their earliest fossil records occurred in the strata of about 250 million years. Cycas tanqingii D. Y. Wang, described by Wang Ding-Yuo in 1996, distributes in mountainous areas in south-eastern part of Yunnan, China. C. tanqingii requires many years of growth before florescence and its sexuality is almost impossible to be identified based on the morphology of other than reproductive organs. Lack of sexual knowledge decreases the effectiveness of seeding nursery and ex situ conservation. The technology of identifying sexuality of young C. tanq