反义TIMP-1对实验性肝纤维化影响研究.pdf

反义TI胛一l对实验性肝纤维化影响的研究 姓 名：李 睿 (内科学) 指导教师：郑 勇 教 授 摘 要 背景与目的：肝纤维化的主要特征是肝脏内细胞外基质(ECM)的生成和降解的失衡，调节ECM 合成、降解的～个重要环节是基质金属蛋白酶一基质金属蛋白酶抑制因子(MMPs，TIMPs)系统，其 纤维化的发生发展。国内外学者一致认为：肝纤维化过程中TIMP．1表达增高、抑制了MMPs的活 性，可促进肝纤维化的发展，因此抑制TIMP—i的表达也是阻止肝纤维化发生、发展的重要环节。本 研究旨在构建反义TIMP-l真核细胞表达质粒，以脂质体包埋后将其导入大鼠肝纤维化模型并获得 有效表达，以观察外源治疗性质粒的疗效，探讨基因治疗肝纤维化的可行性及有效性，为今后I临床 肝纤维化的基因治疗提供理论依据。 材科与方法： 1、反义质粒的构建：以Trizol Reagent抽提肝组织中总RNA，采用套式引物，以逆转录巢式PeR 的方法扩增TIMP．1目的片段并经测序鉴定，双酶切纯化TIMP．1 TIMP-I／PCDNA3 1(+)真核细胞表达质粒： 2、反义质粒的鉴定：酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证实质粒构建是否成功； 3、肝纤维化模型的复制及干预治疗：以复台因素440％CCl4 3ml／kg皮’F注射，每隔4天一次， 首剂加倍；15％酒精为唯一饮用品：饮食采用高脂高胆固醇复合饲料)SD大鼠随机分为正常对照组 质粒组)；继续造模，40％四氯化碳植物油溶液皮F注射，前后共11次，第52天结束注射，空质粒 1 物，取剩余N组(12只)、AT组(11只)、C组(11只)、P组(10只)肝绸织； 4、结果观察：应削苏木素一伊红染色(腿)、苦味酸一酸性复红染色(VG)观察肝组织病理形 胶原的表达，并应用计算机图像分析技术半定量监测其蛋白表达的强弱。实验结果采用SPSS软件 作单网素方差分析(多样本均数的两两比较)，病理学形态分级结果作Ridit检验： 结果：1、反义TIMP．1／PCDNA3．1(十)真核细胞表达质粒构建成功； 2、实验过程中正常对照组和反义TIMP．1组未见大鼠死亡，其余两组死亡率在正常范围，肝 纤维化程度在。一vI级不等： 3、正常对照组和反义TIMP．1质粒组、空质粒组、肝纤维化各组III型胶原的蛋白的表达灰 分别为：217169±3．703、204．962±3．789、189．727±3．058、190．916±3 097；MMP．13的灰阶值分 别为216．287±5．209、215．016±3 纤维化组、空质粒组相比TIMP-1、MMP-13、Ill型胶原的表达明显减少(P0 05)，空质粒组与肝 纤维化组无显著性筹异(P0．05)：正常对照组与备实验组之间的病理学分级有显著性差异(P005)： 反义TIMP一1质粒组病理学分级较空质粒组及有明显改善(PO．05)：空质粒组与肝纤维化组无显著 性著异(P0．05)； 结论： 1、反义TIMP-I／PCDNA3．I(+)真核细胞表达质粒构建成功； 2、大鼠实验性肝纤维化模型复制成功： 3、反义TIMP—I／PCDNA3．1(+)真核细胞表达质粒对纤维化病理学分级有改善： 度上减轻T1MP．1对MMP．13活性的抑制作用； 抑制作用： 的含量，抑制胶原的沉积； 7、反义TIMP一1／PCDNA3．1(+)真核细胞表达质粒使肝纤维化的发展受到抑制； 关键词：反义；TIMP-1；MMP-13；胶原III：肝纤维化；细胞外基质；基因治疗 TIMP-1 antisense