培养细胞对糖代谢异常环境的基因应答研究.pdfVIP

培养细胞对糖代谢异常环境的基因应答研究 目的：通过研究体外培养细胞在严格控制的条件下对微环境内、外糖代谢基本物 质含量变化的基因应答，深入探索发生在糖尿病视网膜病变中的糖生物学 调控机制。 方法：建立稳定的正常人二倍体成纤维细胞与各物种血管内皮细胞的无糖培养环 境，为单因素分析实验打下基础；在模拟生理条件激活细胞膜糖转运系统 后，精确改变培养环境内基本糖代谢物质以及关键中间产物的含量，了解 上述细胞的生物学行为应答：运用DNA分子杂交原理与抑制性PCR技术构 建样本闻差异表达基因的cDNA克隆文库。 结果：人成纤维细胞和各种血管内皮细胞能够在传代期以无糖培养基替换原有培 养基必要的时间而不影响细胞增殖，这将有利于其后药物刺激实验的精确 进行和差异表达基因的克隆。与对照组比较，20mM葡萄糖培养环境对各 种细胞的生长特性产生不良影响，作用4小时后使细胞膜收缩，形态变圆， 贴壁质量下降，细胞数量减少；使用消减杂交技术成功构建出人血管内皮 细胞样本间差异表达基因的cDNA文库，转染ToplO大肠肝菌后从T载体 内克隆出特异性的差异cDNA，表明培养细胞在转录水平发生了活跃的改 变：2mM氨基葡萄糖一6一P或乙酰氨基葡萄糖一6-P在作用4小时后严重改 变了正常人二倍体成纤维细胞的生存状态，使之无法继续贴壁生长，血管 内皮细胞则虽然发生形态改变，却仍然保持贴壁，显示出明显的毒性耐受 能力。 结论：高浓度的葡萄糖或其活性代谢产物对培养细胞产生的毒性作用与其对转录 水平的调控有关，氨基己糖生物合成途径产物对糖尿病视网膜微血管并发 症的出现具有很强的刺激能力，血管内皮细胞对毒性代谢产物的基因应答 可能在糖网病的发生机制中占据核心地位。作为连接蛋白质翻译后乙酰胺 糖基化修饰体系的底物合成和糖缀合物分解产物进入三羧酸循环产生能 量之间的唯一调节通道，磷酸氨基葡萄糖脱氨旁路对保持能量代谢和糖生 物学调节平衡具有重大意义。本研究结合编码基因抑制性消减杂交技术和 糖尿病视网膜病变发病机制研究的最新进展，在已取得的实验结果基础上 提出UDP—GlcNAc代谢池的阀门控制模式假设，为探索糖缀合物代谢与蛋 白质翻译后修饰参与糖尿病视网膜病变的机制及新的诊治方法奠定基础。 关键词：细胞培养；糖尿病视网膜病变；抑制性消减杂交；葡萄糖毒性；氨基己 糖生物合成途径；发病机制 分类号：R774 in The ofCulturedcells TranscriptiveRegulation SaccharometabolicAbnormal ity the ofdiabetic Objective：Toexploreglycobiology—relatedpathogenesis the of transcriptiveregulationstringently retinopathybystudying to ofbasic involvedin culturedcells the changes components responsive the of metabolism。 processglucose Methods：Toset astable environmentforhu