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低剂量脉冲超声波对培养细胞 的生物学效应研究 中文摘要 研究生:孔璐 导师:赵进顺 教授 东南大学公共卫生学院 超声波是指振动频率大于20kHz的声波，它是存在于生产和生活环境中的一种物理因素 目前，超声波已在1_业生产、医学、生活等多个领域中获得了十分少’泛的应用。本课题旨在研 究低剂量脉冲超声波刺激对体外培养细胞的生物学效应。用不同条件下的低剂量脉冲超声波刺 激体外培养细胞，采用MTT比色法、BrdU掺入法、酶谱法和Westemblot法观察研究细胞增殖 效应情况:用AnnexinV法分别检测人皮肤成纤维细胞和人胰腺癌细胞 ((MiaPaCa-2)的凋亡情 况。从而为合理利用作为物理因素的超声波的有利生物学效应，防止不良作用，以服务于增进 人体健康提供科学依据。全文分为两人部分，共五章: 一、低剂量脉冲超声波刺激体外培养细胞增殖效应的研究 1低剂量脉冲超声波对人皮肤成纤维细胞增殖的刺激作用研究 采用MTT比色分析和BrdU掺入两种实验方法，来测定受不同条件低剂量脉冲超声波刺激 后的体外培养人皮肤成纤维细胞的增殖情况。实验结果表明，在一定刺激时间内，低剂最脉冲 超声波能促进人皮肤成纤维细胞增殖，其增殖情况与超声波的刺激时间以及细胞培养液的成分 有关。在培养液不含小牛血清，即细胞在无生氏所必需的生长因子的环境下培养时仍能止常生 长。受低剂量脉冲超声波刺激的各剂量组细胞较对照组均有升高。其中在MTT法测定细胞活性 中，细胞培养液不含FCS时，超声波刺激时间为6min,llmin和20min的剂量组的吸光光度值 较对照组都有显著性增高，且差异具有统计学意义 均〔为p0.01)，其峰值在11min;而细胞培 养液含5%FCS时，超声波刺激时间为6min,11min和20min的剂量组的吸光光度值较对照组都 有显著性增高，并具统计学意义 (p0.05,p0.01,p0.05)。在BrdU掺入法测定中，细胞培 养液不含FCS时，超声波刺激时间为8min和14min的剂量组的BrdU阳性着色细胞率与对照组 比较有显署性增高 (P0.05,p0,01),而细胞培养液含I0%FCS时，超声波刺激时间为5min, 8min,lloun,14min的剂量组的BrdU阳性着色细胞率与对照组比较均有显著性增高(p0.01) 且培养液的FCS含量分别为0%,5%和10%时的剂量组，BrdU阳性着色细胞率的高峰值均在低剂 量脉冲超声波刺激时间为8min-llmin时。 2低剂量脉冲超声波对人皮肤成纤维细胞外基质金属蛋白酶合成刺激作用研究 用不同时间的低剂量脉冲超声波刺激人皮肤成纤维细胞后，采用酶谱法测定细胞培养上清 液中基质金属蛋白酶 (MMPS)活性的变化情况。结果显示，细胞接受不同时间低剂量脉冲超声 波刺激以后，培养上清中UPS的活性发生了不同的变化。在一定时间范围内，随低剂量脉冲超 声波刺激时间的延长，WPS的表达增强。其中，低剂量脉冲超声波刺激时间为6min,11min和 20min时，MPs 的活性均有增高，而以11min时，MRS的活性最强。 3.低剂量脉冲超声波对人皮肤成纤维细胞酪氨酸磷酸化水平的刺激作用研究 采用不同时间的低剂量脉冲超声波刺激人皮肤成纤维细胞后，继续培养6h，然后用Westem blot法测定细胞内酪氨酸磷酸化水平的变化情况。实验结果显示:在一定时间范围内，随低剂量 脉冲超声波刺激时间的加长，细胞内酪氨酸磷酸化水平逐渐升高。其中刺激时间在10min和20min 时，细胞内酪氨酸磷酸化水平均有升高，而以20min组的升高最为显著，并达到高峰。而随着 刺激时间的继续延长，酪氨酸磷酸化水平并不继续增加，反而呈逐渐下降趋势。 二、低剂量脉冲超声波刺激体外培养细胞凋亡情况的研究 1.低剂量脉冲超声波刺激对人皮肤成纤维细胞凋亡的诱导作用 采用AnnexinV法测定低剂量脉冲超声波刺激对人皮肤成纤维细胞凋亡的诱导作用。研究结 果显示，低剂量脉冲超声波刺激人皮肤成纤维细胞超过一定时间后，少量细胞开始出现凋亡， 且随着刺激时间的进一步延长，凋亡细胞数逐渐增多，其凋亡程度也逐渐加重。其中超声波刺 激时间为60min,80min和 100min剂量组的细胞凋亡数与对照组比较差异有统计学意义 (n).01). 2.低剂量脉冲超声波刺激对人胰腺癌细胞凋亡的诱导作用 采川AnnexinV法