两种泥鳅SoxE亚族和DMRT1基因的结构与功能分析.pdf

摘要 本文利用RACE方法克隆得到了两种泥鳅肋翘亚族全部成员基因和大鳞副泥鳅 研究，为了更进一步确定目的基因的表达部位，我们利用RNA原位杂交法分别对两种 泥鳅的性腺和不同发育时期的胚胎进行了杂交，主要研究结果包括下面三个方面： 1．泥鳅勋翘亚族基因的克隆和表达模式分析 本研究根据其它物种勋船和鼢JD基因HMG保守区序列，设计两对简并引物，并 在此基础上采用RACE方法从泥鳅脑中分离得到了施亚族各成员CDNA全序列： 半定量RT-PcR和荧光定量RT-PCR结果显示：在泥鳅胚胎发育的各个时期， 讹姚和讹．S踟6的表达趋势相反但是都从原肠胚开始一直持续到卵黄吸尽期， 施．妣勉和胁．妣96的表达量都逐渐升高，在孵出期期表达量最高，讹．‰JD的表达 量逐渐增加，孵出期达到最高；在泥鳅成体的不同组织中，．妣E亚族各个基因都广泛 存在，讹姚和讹删在脑中的表达量较高，胁鼢勉和讹瓤妨在性腺中表达 量最高，．妣J，D在心脏中表达量最高。 原位杂交试验结果显示：勘姬亚族的五个成员都在泥鳅未成熟的生殖细胞(卵巢的 卵原细胞、初级卵母细胞，精巢中的精原细胞和精母细胞)中表达，因此推测跏亚 族的五个成员可能调控泥鳅性腺的发育和分化；整体胚胎杂交发现，勋姬亚族的五个 成员均在体节形成期的体节中大量表达，之后一直到尾芽期的胚胎脊柱中都有很强的阳 性杂交信号，孵出期以后勋翘亚族的五个成员的表达主要集中在泥鳅的脊柱、体节和 头部。 2．大鳞副泥鳅勋妇亚族基因的克隆和表达模式分析 本研究根据其它物种胁8和胁J『D基因HMG保守区序列，设计两对简并引物， 并在此基础上采用RACE方法从泥鳅脑中分离得到了阢翘亚族各成员cDNA全序列： 码492个氨基酸的开放阅读框。 期，凡坶娥鼢、凡缌甜肋、舭96和溉JD的表达量都逐渐下降，凡舭的表达量 则相反呈现上升趋势；在大鳞副泥鳅成体的不同组织中，勋翘亚族各个基因中广泛存 在，并且都在性腺中大量表达，除此之外A舰在脑中的表达量也很高，溉肋、 溉9口和溉妨在肝中的表达量均较高，溉JD在心脏中表达量高。 跏亚族的五个成员在大鳞副泥鳅性腺和胚胎中的原位杂交试验结果与泥鳅的一 致。 3．大鳞副泥鳅蝴刀基因的选择性剪接和时空表达模式分析 本研究根据其它物种剧缎丌基因DM保守区序列，设计一对简并引物，并在此 基础上采用RACE方法获得了大鳞副泥鳅蝴刀基因的cDNA全长。结果表明：在大 鳞副泥鳅中期刀基因存在选择性剪接。大鳞副泥鳅中得到五条蝴刀基因，分别 R蝴刀口J~3具有相同的开放阅读框，包含5个完整的外显子，编码267个氨基酸， 其差异主要在于3’非翻译区长度和序列不同；Pc蝴丌6缺失了第四个外显子3’末端的 9bp和第五个外显子，编码220个氨基酸；凡凇刀c则同时缺失了第四和第五个外显 子，并利用一段长63bp的额外序列在其编码框末端充当第五个外显子，编码196个氨 基酸。 II 因在成体不同组织和胚胎发育不同时期的表达谱。结果表明：大鳞副泥鳅蝴”基因 只在精巢中强烈表达，而在卵巢中不表达或只有极微弱表达，这与其它物种中的研究结 果相一致；在胚胎发育的各个时期大鳞副泥鳅删灭丌基因均有表达，但表达强度又各 不相同，呈现先上升后下降的表达趋势。由此，推断大鳞副泥鳅的D舰刀与雄性性腺 分化和发育具有明显的相关性。这些结果为阐述蝴刀在脊椎动物体内对性别决定和 性别分化的作用奠定了基础。 综上所述本研究结果证明：1．两种泥鳅勋舾亚族至少由五个成员组成：姚、 蚴、姚、姗和．S缸JD；2．本实验首次发现在两种泥鳅中瓤8基因都具有两个 亚型姚和删，目前仅发现河豚勋嬲基因具有以上两种亚型，其它物种中未见到 相关报道；3．两种泥鳅中．S踟基因也都具有两个拷贝姚和勋矽6，而舰JD基因只 存在一个拷贝，这与部分己报道的物种一致；4．我们发现大鳞副泥鳅的蝴丌基因存 _ 在选择性剪接；5．本实验首次利用多种检测方法对各个目的基因的表达模式进行了系统 研究。勘姬亚族各成员之间存在功能冗余，它们对两种泥鳅神经系统和生殖系统的分 化具有重要作用；蝴刀基因可能是一个与精巢的形成和精巢的功能维持有关的性别 分化基因。 关键词：勋姬，删R，RACE，原位杂交，选择性剪接，泥鳅，大鳞副泥鳅 ABSTRACT Wb0btai