抗老年痴呆海洋药物971抗Aβ神经毒性及作用机制的研究.pdfVIP

抗老年痴呆海洋药物971抗AD神经毒性及作用机制的研究 抑制，细胞数目变多、悬浮细胞数量减少，且随着药物剂量增加，这种改善作用 越明显，提示971可明显抑制Ap的神经细胞毒性。同时，我们也观察了971对 不同老化程度的Ap(即孵育不同时间)细胞毒性损伤的影响，结果表明不同老 化程度的Ap对神经细胞均具有不同程度的损伤，随着AP老化程度的增加，其毒 性越强 老〔化12,24,48小时的API-4o使细胞存活率分别降至84.2%,73.5%, 68.7%)，但如果在老化过程中加入100gg/ml的971,AP的细胞毒性作用明显降 低，提示971抗Ap神经毒性可能与抑制其纤丝形成有关。另外，本实验还观察 了971先孵育再加Ap损伤、971与Ap同时加入细胞、Ap先损伤再加971这三种 处理方式的神经细胞存活情况，从而确定971抗Ap神经毒性的作用环节。结果 发现，在这三种处理方式中Ap损伤细胞程度不同，但无论是哪一种处理方式， 971实验组细胞MTT还原能力均高于Ap模型组，表明971可多环节抑制Ap神 经毒性。 3.971对Ap引起神经细胞损伤保护的作用机制探讨 (1)在细胞水平上探讨971抗Ap神经毒性的作用机制 首先是在细胞水平上探讨了971保护Ap诱导神经细胞损伤的作用机制。结 果发现，30AMAp可明显诱导神经细胞凋亡 (凋亡率为24.8%)，而加入50,100 pg/ml的971后，SH-SY5Y细胞凋亡明显受到抑制。深入探讨971抗Ap所致神 经细胞凋亡的作用机制发现，971可明显抑制Ap诱导的神经细胞内游离钙离子 浓度的升高、自由基的产生、细胞脂质过氧化产物含量的增加，线粒体膜电位的 降低以及凋亡促进蛋白P53和Caspase-3蛋白表达的升高，并促进凋亡抑制蛋白 Bcl-2表达的上调，提示971拮抗Ap细胞毒性损伤是通过其抗氧化、抑制胞内游 离钙浓度的升高而增加凋亡抑制蛋白的表达、阻断下游凋亡促进蛋白的表达，从 而最终抑制细胞的凋亡。 (2)在分子水平上探讨971抗Ap神经毒性的作用机制 ①971对Ap纤丝形成及解聚的影响 采用荧光分光光度计及电镜，观察了971对Ap纤丝聚集及解聚的影响。971 对Ap纤丝形成影响的结果表明，Ap在12--48小时内，随着孵育时间的延长，纤 丝形成明显增加，Th-T染色的荧光强度逐渐增强 (12,24,48小时Ap的Th-T 抗老年痴呆海洋药物971抗A日神经毒性及作用机制的研究 染色荧光强度分别为:21.1,31.7,39.1)。然而当有971存在时，该纤丝形成过 程明显被抑制，荧光强度明显减弱，并且随着药物浓度的增加，该作用越明显。 同时采用Th-T荧光染色和透射电镜观察了971对肝素促Ap纤丝形成的影响，结 果表明，肝素可明显促进Apt二纤丝形成，加入肝素后的M-T染色荧光强度明 显增加，电镜结果也表明加入肝素后的纤丝聚集更明显。然而当971与肝素共存 于Ap溶液中时，Th-T荧光强度明显减弱，纤丝变短，聚集程度明显降低。另外， 还采用透射电镜观察了971对己形成纤丝Ap解聚的作用，结果表明，Ap纤丝相 互交错，相互聚集成束。而加入971后，A3(纤丝量明显减少，聚集程度降低、 并且断裂变短。上述实验提示971可明显抑制Ap聚集、纤丝形成，并促进纤丝 化Ap的解聚，这是971抗Ap神经细胞毒性的重要作用途径。 ②971对Ap构象改变的影响 采用圆二色谱技术探讨了971抑制Ap纤丝形成的具体环节。由圆二色谱图 可以看出在6-24小时间，Ap1-40随着孵育时间的延长，逐渐由a-螺旋转变为p- 折叠，24小时时基本呈p一折叠结构，而971可明显抑制该构象转变过程，使p- 折益构型明显减少，提示971抑制Ap构象改变是阻断其纤丝形成的重要原因。 ③971与Ap相互作用的研究 采用生物传感芯片和计算机模拟技术探讨了971抑制A3(纤丝形成及促进其 解聚的作用机理。首先采用SPR技术观察了971与Ap的结合情况，结果发现971 与新鲜的和不同老化程度的Ap1-4。都有结合，老化。、0.5,1,2,4,6天的API-4o 与971结合的KD值分别为6.85E-07,1.07E-07,9.06E-08,5.43E-08,2.15E-08, 1.45E-08M，提示971可能是通过与Ap结合而抑制其纤丝形成、促进纤丝解聚、 进而拮抗纤丝化Ap的神经细胞毒作用。为了确定971在Ap分子上的结合区域， 我们首先采用计算机模拟技术研究了971片断与不同API-4o,AP25-35片断的对