利用抑制性消减杂交SSH技术研究鳗弧菌不同毒力菌株的基因多样性.pdf

利用抑制性消减杂交(SSH)技术研究鳗弧菌不同毒力菌株的基因多样性 利用抑制性消减杂交(SSH)技术研究不同毒力的鳗 弧菌菌株的基因多样性 摘要 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种引起鱼类弧菌病的重要的条件性致病菌， 在世界各地流行，能感染八十余种海洋及河口鱼类，也是我国海水养殖的花鲈、 牙鲆、大菱鲆等动物的重要病原菌，常给水产养殖业造成较大的危害，因此对该 菌毒力相关因子的研究对于其防治具有重要的意义。目前已发现的鳗弧菌毒力因 membrane protein，OMP)等。然而，总体来说对鳗弧菌众多毒力因子的研究大 多数集中在强毒株上，而对弱毒株或无毒株的报道极少，这就为毒力因子的鉴定 带来了困难。而且强毒株、弱毒株和无毒株之间的毒力差异不能用目前这些已知 因子的有无加以解释，因而推测有其它因子导致其毒力差异。 遗传关系密切而又具有一定生物学特征差异的两种或两株细菌的比较基因 组学研究受到普遍重视，因为在某一菌株存在而在另一菌株缺失的基因可能具有 subtractive 很重要的分子生物学意义。抑制性消减杂交技术(suppression 选差异基因的方法。它利用强毒株作为检测子(tester)，弱毒株或无毒株作为 驱动子(driver)，将强毒株与弱毒株基因组一致的大量冗余部分去除，提炼出 更具有研究价值的信息。消减杂交通过对强毒株及弱毒株的差异显示使研究方向 更具针对性，消减杂交的片段可以作为候选的毒力相关因子的标志，让我们距离 事实真相更近一步，具有简单易行、特异性高、能分离出低丰度差异片段等优点。 rerio)存在明显的 两株鳗弧菌菌株VIB72和CWl对斑马鱼(Brachydanio 103 毒力差异(菌株VIB72的LD50-4．17Xcfu／per ×106 fish)。本研究从两株鳗弧菌菌株的毒力差异出发，采用抑制性差 cfu／per 减杂交技术构建特异性的DNA差减文库，将消减文库中特异表达的DNA片段 利用抑制性消减杂交(SSH)技术研究鳗弧菌不同毒力菌株的基因多样性 插入载体，转化大肠杆菌，扩增文库后，经蓝白斑和抗生素初步筛选，随机挑取 白色克隆进行菌落PCR分析插入片段，通过菌落PCR从384个随机挑选的差减 文库克隆中筛选出187个阳性克隆，占总数的48％。经过斑点杂交进一步筛选出 59个差减克隆的插入片断，这些片段只存在于菌株VIB72中而在菌株CWI中缺 失，并对成功测序的55个片断进行同源性分析，这55个片断中有30个(约占 55％)与已知蛋白或假定蛋白的编码基因有序列同源性，其中17个与已知蛋白 的编码基因有序列同源性。 这些己知蛋白有：可溶性溶胞壁质转糖基酶、转移蛋白MobA和MobC、转 座酶IS66、抗性相关蛋白(金属13．内酰胺酶和乙酰转移酶家族)、毒素蛋白 (DT-201和alveicinA免疫蛋白)、与OLD家族相似的ATP依赖性核酸内切 数在其他细菌中有一定的毒力作用，但在鳗弧菌中还是第一次被发现。由此可以 推断，这些基因片断有可能是鳗弧菌毒力岛的一部分，其完整基因编码的蛋白因 子极有可能在鳗弧菌致病过程中能发挥巨大作用。这些片断的发现为进一步研究 该菌的致病机理奠定了良好的基础。此差减文库的构建将减少克隆鳗弧菌毒力相 关基因的盲目性。本研究发现的潜在毒力基因片段，可借助染色体步移等技术， 克隆出其完整的毒力基因，为进一步研究该菌的致病机理奠定良好的基础。同时 以上毒力基因片段亦可用于鳗弧菌毒力菌株和非毒力菌株的鉴别。 关键词：鳗弧菌；抑制性消减杂交；遗传差异；毒力基因 2 利用抑制性消减杂交(SSH)技术研究鳗弧菌不同毒力菌株的基因多样性 of betweenstrainsof diversity Analysisgenetic