梅山猪LHβ基因克隆及其表达效应研究.pdf

鲤删杰堂些主鲎堡垒生—— 梅出猪LI-I-垫基因克隆及其表达效应研究 遗传学专业 博士研究生吕学姨攒罨教燃，4世贵栽拨 鉴于瑾一§是动物生殖裁发育调留孛十分关键馥性激素，趱内多}对 猿L卅§基鼠的硖究甚少，尚拳她到对篡在体内外转纂殴表达及其对确 耪免疫积垒菹系统翁深入研究，西藏，我秘裁梅由猪LH一器基霞静壳喙 及其原核、真核表达和体内转蘩因表达对小鼠嫩殖和免疫系统作用和机 理透行了鞍系统耱研究，蠹葫戳骞蘑新型褰效警整满节基嚣趔龆奠定坚 实基础。 酋先，我们率先克隧了优良高产地方猪种梅山猪LH-8基风。从梅． 出猪藕壤薅弹f舔蕤蔽睬矗嚣，弼鼹一怼R懿方法克隆获褥了簿由猪睡一叠· 基因，与其他地方来源于猪Ltt一13有98％同源，其开放阅读椴长度为 417bp，缠褥139令氮基酸残鏊，鸯子鬣舞14．7kD，等邂焘为7。80，疏 水氨基酸占55．4％，亲水氨基酸占31．7％，碱性氨基酸占7．9％，酸性氨 罄酸占；5。溅。鏊霞翳1-31位棱彗酸虢璐强个氨萋酸残基豹信号获， 31-448位核苷酸编码139个氨毓酸残赫的成熟片段。 x 第二，用DNA重组技术将己克隆的猪LH一8cDNA片断插入pGEX一1 雩曩粒，褪建了猪U4一§蘩毽静臻棱表达矮较螨秣j{-§，转键大瓣梧骜， 以质粒PCR和BamlfI、EcoRI双酶切筛德鉴定转化子，获得了台420bp 插入灸隧纂霹蔗璐敷螫缀+f。娃fl，联；诱导融会缀癌表达，经RT-PCR稔 测发现42050的特异靛“卜B条带；通过SDS-I，^GE分析，在43KI)处m 珧锚1’～川卜转融合赞巍条举，其表达餐占甚缨涟蛋鑫餐敬孙懿，涎孵 ， ． 墨兰堡!苎生整曼!二!燕璧箜查熊热垒兰苎壁壁查…．一—— 猪Lt|一p繁因得到了雁确转泵和表达。提墩纯化回收融台蘑组蛋自，并 鑫譬缀蛋爨受痉家兔，瑟蚕了耱舅整摭蒋漓魔隽25800揍猿浯§戆毫 免兔瓶清。 第三，曾次将克隆判的猪LH-0基因距克隆到真核表达型载体 VRl020上，瀵遘囊辍蕊鬟蜂方法建转毯子孛簿选辍链亮囊；麓豫稿l、 II双酶切鉴定重组子。得到的羹组真该表达质粒转染Cos7细胞株， Bgt 鼹一簿{l梭戮猿臻一§+结祭黢示；邋涟囊疑赎建袭黢_酶凌努撩，褥辩猿 LH-辟基因以正确方向插入的重组粪核表达质粒VPLI_}一B。重组质粒 VPLH-§经糕矮体夯嚣转染Cos7缨魏，培莽不藤黠瓣瑟撬墩鞲R懿避蠢 RT-PCR，发臻转黎缁脆RNA中含有与LH-璺基因对应的mRNA；这些结果 表嘲汪成功槐建了既}l一§麴冀核表这蒺粒，熊歪酶转录表达城一§。 篇四，为了探讨VPLH-目体内转旗因袭达对小鼠嫩殖和匏疫岽统的 嚣蒂佟霉襄撬理，，筏錾{萋浚鼹簧辩璃子瓣袋傣蓬装VPL鞋-昏爱毅，与 PMSG和hCG以及麓组LH-爵蛋白分别肌肉淀射小鼠。系统地研究了它 襄对夺簸戆畿蓬襄凳痰爨鼹瓣影黎。实验蘩巢爱襞；簧窭验缀枣惑豁篱 血液的免疫细胞数懿均较对照组增多，在14天时蓑异显著(Po．05){ 盔溃lgG鑫爨豁较对爨枣爨骥显臻搬，葜孛媛登、瓢F缓较突塞。蕊赛 验组衄清中LH和FSH的永平均比对照组升高，实验组之间簸异不明屡 ￡羚§。艇。实验缝爨麓每鬻产睾}数茨袋逶拳蚜赛予对照缝，警缘多1．4 只。僚各实验缀问差异不显箸(PO．05)。这黧结果初步表明：本实验克 篷稳建楚猿VPLH一塞茨整、蘩缝L酚§篮鑫埝麓笈箨骥显夔燮建警爨溪 节弗掰。哥较好地促缓雌性动物的摊卵、怀孕和正常产仔{并且对动物 瓣兔嶷撬锈凳苓炎影l穗，遥袭理篷一定戆舞癀漤强毅霾。鬻蕊予鬻臻俸 分子包装VpbH一§质粒体融转染表达安全无毒耐作用。本实虢为迸…、涉 深入磺窕瑟爨赫犊生装生鑫谜繁垫爨艇裁、羚潞褒效安全、经涛篷缆懿 挺进动锈繁麓豹新途经受定。j’露好的纂础。 关建漏；猪，l崩一彗， 鏊瓣宠隧， 耩闪裘达。牛殖，免疫 ．． ． 竖趔盔堂氅点翌垒望塞一一 its Molecularof and