粤东地区橄的榄种质资源遗传多样的ISSR分析.DOCVIP

粤东地区橄榄种质资源遗传多样性的ISSR分析_论文网 导读:：橄榄（Canariumalbum.L）。其遗传多样性水平也缺乏科学有效的评估。分析和电泳检测。对该地区橄榄种质资源一直缺乏系统的研究。关键词：橄榄，遗传多样性，ISSR，种质资源　　橄榄（Canarium album.L），属于橄榄科(Burseraceae)橄榄属(Canarium)，是我国南方重要的亚热带水果。其果实营养丰富，鲜食或加工均可，是卫生部批准的药食两用果品之一。粤东地区具有悠久的橄榄栽培历史并且保留了众多优质橄榄品种，当地至今仍保存着大量树龄达数百年的橄榄古树。但是，对该地区橄榄种质资源一直缺乏系统的研究论文网，其遗传多样性水平也缺乏科学有效的评估；同时粗放的种植和管理，导致一些优良的品种或特有的农家品种正逐渐减少或消失。因此，亟待开展相关的研究和保护。　　近年来，随着PCR技术的发展，涌现出多种基于PCR的分子标记技术，并被广泛应用于植物种质资源亲缘关系以及遗传多样性的研究。其中，由Zietkiewicz等[1]提出的基于PCR的单引物ISSR(InterSimple Sequence Repeat)分子标记技术已在植物亲缘关系分析[2、3]、遗传多样性分析[4、5]、遗传图谱的构建[6]等方面广泛应用。DNA分子标记技术也被引入对橄榄的研究，如聂珍素[7]利用RAPD技术分析福建部分橄榄种质的亲缘关系；宋亚娜[8]通过ITS序列对14份福建橄榄进行鉴定和分类。本研究利用ISSR 标记技术对粤东地区64份橄榄种质的遗传多样性进行较为全面的调查研究以及评估，以期为该地区橄榄种质资源保护管理、核心种质建立以及进一步的育种计划提供相应的理论依据[F6]。　　1. 材料和方法　　1.1 材料来源　　试验样品采集自粤东地区(汕头市、潮州市、揭阳市和梅州市)，共计64份橄榄(Canarium album.L)种质(见表1)。采样时摘取无损伤的叶片，放入封口袋并用硅胶干燥保存。　　1.2 主要试剂和仪器　　主要试剂：Taq DNA 聚合酶、dNTP和100bp DNA Ladder Marker均购自TaKaRa(宝)生物工程(大连)有限公司；ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(Univesity ofBritish Columbia, Set.No.9, No.801-900)提供的序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司。其他试剂为国产分析纯。　　1.3 橄榄DNA提取　　橄榄基因组DNA提取采用改良的CTAB法[9]，并用DNA纯化试剂盒对DNA原液做进一步纯化，具体步骤如下：1．取0.1克左右的材料置于陶瓷研钵中并加入液氮，充分研磨，成粉末状。2．往研钵中加入65℃预热的2times;CTAB提取缓冲液论文网，将粉末状的材料研磨成匀浆并转入1.5ml离心管中，再加入适量的beta;巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温30-40min，期间不时摇动混匀。3．将离心管中的匀浆分装到两个1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，充分混匀，室温静置5min，室温下10000r/min离心10min。4．重复步骤3一次或两次。5．取上清液加2-2.5倍体积的无水乙醇，小心摇动，出现沉淀，得粗DNA。短时离心后倒掉上清液，于沉淀中加1mol/L NaCl 400mu;L，待沉淀溶解后，加等体积氯仿:异丙醇(24:1)论文网，摇匀，室温静置5min，室温下10000r/min离心10min。6．去上清加2-2.5倍体积的无水乙醇，小心摇动，使DNA沉淀。7．短时离心去除上清，加入70%乙醇洗涤沉淀、风干。8．将DNA溶解于100mu;lTE缓冲液，待DNA完全溶解后再用快速纯化试剂盒对DNA溶液进行纯化。9．用1.0%琼脂糖凝胶电泳（1times;TAE）检测总DNA的质量，利用Biophotometer 生物分光光度计(德国 Eppendorf公司)测定DNA纯度和浓度，最后将DNA保存在-20℃冰箱里备用。　　表1 供试橄榄种质材料　　Table 1 Canarium album accessions used for[F7] this study　　 编号Code 品种Cultivar 采集地Locality 1