FANCD2+shRNA干扰对头颈鳞癌颈淋巴结转移细胞化疗敏感性影响和机制研究.pdfVIP

FANCD2 shRNA 干扰对头颈鳞癌颈淋巴结转移细胞 化疗敏感性的影响和机制研究 摘 要 目的：头颈部鳞状细胞癌 （Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC ）的发病率在全身肿瘤中居第六位。由于头颈部重要器官集中，淋 巴结丰富，故HNSCC 的颈淋巴结转移使手术和放化疗的疗效受到制约。目 前化疗已在头颈肿瘤尤其是发生颈淋巴结转移进展期患者的临床治疗中广 泛应用。然而原发或获得性耐药的产生降低了HNSCC颈淋巴结转移患者的 疗效。范可尼贫血（Fanconi anemia, FA ）通路功能障碍能够改变肿瘤对DNA 交联剂的敏感性，FANCD2作为FA通路的关键基因可能对肿瘤细胞生长及 化疗敏感性的影响起重要作用。本研究拟通过应用shRNA干扰获得的 FANCD2 沉默效应稳定的HNSCC 颈淋巴结转移HSC-4 细胞系，研究 FANCD2 对HNSCC 生长活性的可能作用并探讨沉默FANCD2 表达对 HNSCC颈淋巴结转移细胞化疗敏感性的影响及相关机制。方法：利用前期 实验成功获得的FANCD2 shRNA沉默的HNSCC颈淋巴结转移HSC-4细胞 系，将实验细胞分为空白对照组：HSC-4 （未经任何处理的野生型HSC-4 细胞），阴性对照组：FANCD2-shRNA-C （含FANCD2无效干扰序列的HSC-4 细胞）和实验组：FANCD2-shRNA （前期实验成功构建含FANCD2有效干 扰序列且FANCD2稳定沉默的HSC-4细胞）三组。经细胞传代，嘌呤霉素 筛选，免疫印迹法（Western Blot ）检测FANCD2基因沉默效应，计算沉默 效率。细胞增殖抑制试验（Cell Counting Kit-8，CCK-8法）检测FANCD2 1 shRNA干扰后HSC-4细胞的生长增殖情况，流式细胞术（Annexin V/PI染色 法 ）测定其凋亡和细胞周期改变； CCK-8 法检测顺铂 （Cis-diamminedichloroplatinum，CDDP ）在不同时间点及不同浓度作用于 HSC-4细胞的抑制率，并计算IC50值，流式细胞术测定CDDP作用后其凋亡 和细胞周期改变以研究FANCD2 shRNA干扰对HSC-4细胞化疗敏感性的影 响。通过Western Blot检测FANCD2 shRNA干扰后Bax 、ERK1/2 、P-ERK1/2 和integrin β1蛋白表达变化来探讨FANCD2与上述蛋白的功能关系；检测三 组细胞DNA交联剂作用后上述通路蛋白表达的变化，研究FNACD2 shRNA 沉默影响化疗敏感性的可能机制。结果：（1）Western Blot证实HNSCC颈淋 巴结转移HSC-4细胞存在FANCD2蛋白的表达；前期实验设计的干扰序列 使FANCD2沉默效应稳定，与对照组比较差异有统计学意义(F=514.179, P0.05) ，沉默效率为86%；（2 ）CCK-8结果显示shRNA沉默FANCD2表达 能抑制HSC-4细胞增殖，且抑制效应具有时间依耐性。不同浓度CDDP作用 48小时，三组细胞抑制率均随浓度增加而增高，各浓度组间 （F=1247.992, P0.05 ）和各细胞组间（F=118.724, P0.05 ）差异均有统计学意义，且实 验组抑制率增加较对照组明显；16μg/mlCDDP作用24 、48 、72小时，三组 细胞抑制率均随时间延长而增高，各时间组间 （F=575.013, P0.05 ）和各 细胞组间 （F=37.709, P0.05 ）差异均有统计学意义，且实验组抑制率增加 较对照组明显；实验组细胞CDDP 的IC50值（16.633±1.137）μg/ml 比空白对 照组（34.567±1.193 ）μg/ml和阴性对照组（30.400±0.089 ）μg/ml 明显降低 （F=229.887, P0.05 ）；（3 ）流式细胞术检测发现三组细胞培养72小时后， 实验组HSC-4细胞凋亡率（13.33 ％）较空白对照组（1.69％）和阴性对照 2