乳脂乳球菌W56抗噬菌体机制的分子生物学研究.pdf

山东大学博士论文 乳脂乳球菌W56抗嘴菌休机制的分子生物学研究 和pJW566携带有三种不同的R/M系统，分别定义为LIaBI,LlaBII和 LIaBIII。正是因为菌株L.lactissubsp.cremorisW56三种不同的抗性机制之 间的相互协同作用，逃脱一种限制的噬菌体而被另一种抗性机制所切割， 所以L.lactisW56在乳酪生产中表现出较强的抗噬菌体特性。这种一个菌 “内同”含有蹄不同R/M系”的现象’乳“酸菌中未见报道。) 本论文主要研究质粒pJW566编码的LIaBIIIR/M系统。在含有新生霉 素的梯度平板上消除Marker质粒pSV2，得到只含有质粒pJW566的菌株 MG1614[pJW5661。经过不同限制性内切酶的切割和连接，绘制了质粒 pJW566内切酶图谱，其中质粒PJW5“上具有唯一的SpeI,Sphl,Nsil及Sad 的酶切位点，含有7个CIal酶切位点. f用限制性内切酶CIal将质粒pJW566DNA不完全消化，所得片段与来 自手质粒PVC5的氯霉素抗性基因连接，得到一个携带有完整LIaBIIIR/M 基因的质粒pJKI，约15.25kb。在质粒pJKI中切除约Ikb的HindRI-HindlII 片段，得到质粒pJK7，含有pJK7的菌株同时失去了对噬菌体的限制和修 饰作用，表明HindIII-HindIII片段对LIaBIII基因是必须的.质粒pJW566 经Nsil和Sad双酶切割，所得片段与来自于质粒pSJ1327的氯霉素抗性基 因连接，得到质粒pJK2，含有该质粒的菌株MG1614[pJK2]具有与 MG1614[pJKI】相同的限制和修饰作用，但生长缓慢。经进一步基因亚克隆 分析，发现LlaBIII基因位于约5kb的sphl-HindIRDNA片段上。 利用WalkingPrimer方法完成了整个LIaBIII基因的核昔酸序列测定。 序列分析表明该片段包含一个4572bp的开放阅读框架 (ORF)，编码一个 .___-..… __1.__ 一一一一一一色一 ‘R一一一一一一 由1576/1584个 (依赖与所使用的起始密码子)氨基酸残基组成的蛋白质， 推测该蛋白质分子量约为180.6KDa,pl为5.52。该ORF有两个相同的起 始密码子ATG，相隔24个碱基，在位于408bp处的ATG上游20个或位于 434bp处的ATG上游8个碱基处，有一段保守的与L.lactis16S-rRNA相匹 配的核糖体结合位点 ((ribosomebindingsite,RBS)AAGAA或AAGGA. 但没有发现保守的启动子序列.但在ATG上游有一段富含嗦吟的重复区域 (GATAAATA,TACAAAAA)，推断该区域对LlaBIII翻译和DNA复制起 调节作用.在终止密码子TAA下游，有一个转录回文信号序列，后为一段 polyT(TTTTGTITIITI)尾巴，表明该结构是一个不依赖于P因子的终 止子。 蛋白质同源性查询发现在LIaBIII蛋白的N一末端有7个保守区域，与 R/M系统I型和III型内切酶的 “DEAH-box”有较高同源性，在7个保守 区域上游还存在具有催化活性的保守序列X。在蛋白的中间区域有4个甲 基化酶的特征序列，依据特征序列的顺序及氨基酸残基的组成，LIaBIII甲 基化酶属于N6-腺pq吟甲基转移酶的Nit类Y组。蛋白的C-末端不同于任 何已知蛋白，推测为DNA的识别区域。 利用定点缺失突变技术，在LIaBIII蛋白的N一末端的motifI内切除6 个碱基对应于Th,z13和S扩14两个氨基酸，呈现R-Nr表型，证实了蛋白质 的N一末端为 L1aBIIIRIM 系统内切酶的功能区域。另一突变株 MG1614[pJK6]，在Spe】位点缺失4个碱基，同时丧失了对噬菌体的限制和 修饰作用，为R-vf表型，证明了该蛋白是由一个ORF编码的蛋白质。在该 蛋白C一末端切掉405个氨基酸残基(D179-1584)，导致突变株MG1614[pJK4] viii— 一lhTxt*Xft乙塑R丝W56燮l些B75鱼丝壑匹一一一. 的内切酶和甲基化酶活性同时丧失，说明该区域为DNA的识别区域，相当 于R/MI型HsdS亚基的功能。删除LIaBIII起始密码子上游富含嚎吟的676 个碱基的重复区域，得到突变株MG1614[pJK10]，呈现RIvT表型。 通过基因结构和蛋白质同源性分析及定点缺失突变，证明了L1aBIII R/M系统是由一个阅读框架编码，具有限制、修