弗氏链霉菌及耐热链霉菌的遗传改造.pdfVIP

中文摘要 替米考星是一种重要泰乐菌素的衍生物，合成方法是通过水解泰乐菌素得到脱 菌素内酯环的C-20位置上加上一个3，5一二甲基哌啶基而成。泰乐菌素合成基因簇 通过弗氏链霉菌一大肠杆菌属间接合转移将该中断结构导入BIBl028，通过同源重 码框缺失的基因置换结构，将该置换结构插入接合转移载体pBIBl015，通过弗氏链 霉菌一大肠杆菌属间接合转移将该基因置换结构导入BIB715，通过同源重组得到 进行了验证，摇瓶发酵实验结果显示主要发酵产物亦为desmycosin。摇瓶菌种筛选 相比出发菌株的9．19／1，通过折算，两突变株的产能达到出发菌株的106±5％。 而且和出发菌株的四种组分(泰乐菌素A、脱红霉糖泰乐菌素B、大霉素C和雷洛 过提取后，desmycosin能够占到总产量的95％，组分更加单一。 我们还对替米考星的合成方法进行了探讨，与传统合成以泰乐菌素成品一磷酸 泰乐菌素为出发原料相比，本研究中所得重组突变株通过发酵得到的desmycosin 米考星的合成。与传统泰乐菌素的70～80％回收率相比，不但简化了反应步骤，而 且提高了得率。HPLC-MS结果显示：合成的替米考星与工业生产的替米考星结构完 全一致。 乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)是另一种重要的泰乐菌素衍生物，它是通过耐热 链霉菌生物转化泰乐菌素，在泰乐菌素的3’一羟基位置乙酰基化和4”一羟基位置 异戊酰基化而得。通过优化，本研究首次建立了优化的耐热链霉菌一大肠杆菌接合 转移系统，整合表达了血红蛋白基因(vhb)，摇瓶发酵结果显示血红蛋白基因的表 达对耐热链霉菌转化泰乐菌素几乎没有影响。通过PCR-targeting和在弗氏链霉菌 中应用的快速基因中断法对负责相应酰基化功能的acyBl-B2基因进行了功能研究， 先后得到acyBl-B2基因中断菌株、acyBl基因中断菌株，并对相应中断菌株进行了 互补，得到相应的基因互补菌株。研究表明：acyBl基因的中断对acyA基因功能没 水平的下降95％以上。研究表明acyB2基因应该是碳霉素生物合成基因簇中的一个 全局性正调控因子，它不仅负责对acyBl基因的正调控作用，而且还至少负责对acyA 基因和红霉糖糖基转移酶基因的正调控。 在耐热链霉菌中存在两个抗性基因，分别为carA和carB,其中carA类似泰乐 菌素的tlrC,为ATP结合转运蛋白；CarB为核糖体单甲基化酶，类似泰乐菌素的 tlrBo为提高AIV生物转化过程中菌体对泰乐菌素的抗性，通过整合表达红霉素 抗性基因(ermE)，抗性平板结果显示耐热链霉菌对泰乐菌素的抗性提高四倍以上， 而相应的酰基化功能没有变化，这对解决工业生产上底物投料浓度问题有一定的 帮助。 of 本研究还对在链霉菌中普遍存在的负调控基因nsdA(negativeregulator Streptomyces 热链霉菌的nsdA基因进行了中断，得到相应的突变株。摇瓶发酵结果显示：耐热 链霉菌nsdA基因的中断可以提高其酰基化酶的酶活，与出发菌株相比，在摇瓶水 平，在相同投料浓度下，nsd4中断株AIV的转化率从82％提高到93％。 本研究还对耐热链霉菌的底物耐受性进行了探索，得到了乙酰脱红霉糖泰乐菌 素和一种新的替米考星衍生物。 关键词：弗氏链霉菌；泰乐菌素；脱红霉糖泰乐菌素；替米考星：红霉糖糖基转移 酶基因ty]CKSOE—PcR；PCR介导的基因中断；耐热链霉菌；乙酰异戊酰泰乐菌素； II Genetic and ofStreptomycesfradiae manipulation Abstract TiImicosinisa macrolideantibioticdedvedfrom semisynthetic tylosin．The traditionalmethodoftilmicosin startswiththeremovalof