重组草鱼干扰素对草鱼免疫保护.pdf

南昌大掌博士掌位。沦文 摘 要 我国的草鱼养殖产量为全球最高，其比重高达95．7％。现今鱼类养殖业通常采用 高密度养殖模式，而这种模式却是造成鱼类疾病快速传播的主要因素之一。我国 的草鱼养殖业因受GCHV感染导致草鱼出血病爆发，死亡率极高，给草鱼养殖 业带来难以估量的经济损失。目前，鱼类疾病防治动辄大量使用化学药物和抗生 素，结果不可避免地出现耐药性，并对环境造成严重污染。使用疫苗虽然可以有 效防治某些特定疾病的发生，但这种方法存在抗病谱较窄的不足。作为变温脊椎 动物的鱼类，其病毒防御体系主要有赖于其非特异性免疫系统。因此，应用具有 广谱性抗病毒作用的干扰素，以降低各类疾病的发病风险的方法将不啻为一种理 想的选择。 本研究在前期成功克隆了一个草鱼I型IFN基因(CilFN)的基础上，构建了 测定，rCilFN蛋白质相对分子质量约38kD，蛋白质浓度为750 J-tg／mL，效价相 抗GCHV效果，结果显示rC／IFN的生物活性与其浓度存在一定的剂量依赖性。 为评估rC／IFN在草鱼活体内抗GCHV感染效果，我们进行了腹腔注射和拌 料投喂等两种不同途径对草鱼的免疫保护效果对比实验。将0．1、1、10“∥g鱼 体重等三种不同剂量的rCilFN经由腹腔注射免疫草鱼，以GCHV攻毒，结果表 明，三种剂量都可以产生较好的免疫保护效力，但以l“∥g鱼体重的免疫剂量为 最佳；另外，以每天拌料投喂rCilFN总量为1 d、 p∥g鱼体重的剂量免疫草鱼1 2d、5d，同样以GCHV攻毒，结果显示连续投喂2d的免疫组草鱼的相对存活 率最高。 的诱导表达效果。体内和体外诱导实验结果均显示，rC／IFN可以显著性地提高 ISG的转录表达水平。与对照组相比，草鱼CIK细胞的Mx和IFN的基因均显著 上调表达，而且分别在6h和12h内达到峰值；与注射同等剂量PBS的对照组 相比，在注射1gg／g鱼体重剂量的rCilFN后，在草鱼肝、脾、肾、肠、鳃、心 表达，其中大多数在12h内达到最高水平，在72h时基本上降低至本底水平； d或连续投喂2～5d后，测定投喂不同时 经拌料投喂1岭rCilFN／g鱼体重剂量1 长的草鱼各组织的IFN基因的诱导表达情况，结果表明投喂1～2d的实验组草鱼 各器官组织中删的诱导表达水平最高。 本研究进一步就草鱼小肠不同区段对rCiIFN的吸收差异性进行了对比研 究。以2I-tg／g鱼体重的剂量经口腔填喂草鱼消化道后，采用冰冻切片免疫组织化 学方法检测并比较草鱼肠道不同区段在完整吸收具有生物活性的rCilFN方面的 差异性。结果表明，草鱼后肠比前肠具有更强的吸收rCiIFN能力。 此外，本研究采用双抗夹心ELISA法分析了rCiWN在草鱼血清中的药物代 谢过程。以0．75 IJ．g／g鱼体重的剂量分别经腹腔注射途径或口服填喂后，在草鱼 血清中分别于2h和3h时达到峰值，其大小分别为159．17 pg／mL和79．06pg／mL， 随后在24h基本降低至本底水平。这种代谢特征大体上符合一级吸收、一级消 除的药物代谢动力学规律。 最后，本研究就rCiIFN的应用可行性进行了初步探索。CilFN基因在重组 菌中诱导表达时生成大量的包涵体，经包涵体变性与复性处理后，可以获得纯度 较高的rCilFN蛋白。5L发酵罐中试结果表明，重组菌仍可稳定地表达出大量的 rCiIFN。吸附与溶解实验表明，颗粒饲料吸附rCiIFN的能力较强，且短时间内 颗粒饲料所吸附的rCilFN在水中的溶解损失较小。 关键词：重组干扰素；免疫保护；干扰素刺激基因；完整蛋白吸收；药代动力学 南昌大掌博士掌位论文 Abstract Grass the offreshwate