新型实时荧光PCR检测体系研究和应用.pdfVIP

新型实时荧光PCR检测系统的研究和应用 摘 要 ， l实时PCR是近几年发展起来的新型核酸检测技术，在临床诊断中 具有极大的应用价值。与常规PCR检测技术相比，实时PCR集扩 增检测于一体，大大提高了核酸检测的自动化程度，有效地消除了 PCR产物污染。尤其是，实时PCR具有卓越的定量能力，灵敏度高， 线性范围宽，结合各类探针技术，更具有极高的特异性。卜1／， 该论文涉及一种新的实时PCR方法的建立和应用，论文分为四 部分： 1．孪生引物实时PCR检测方法的建立。提出一种新型的实时PCR 检测技术——孪生引物实时PCR。摩生引物是根据荧光淬灭和碱基 配对原理设计的两条互补的DNA双链结构，其中一条DNA链是作 为PCR扩增引物，称之为正引物：另一条与正引物序列完全互补， 称之为负引物。我们以检测人13．珠蛋白基因为模型，建立了标记型 和非标记型孪生引物实时PCR方法，证明该方法能抑制非特异扩增 和防止引物二聚体生成。扣7 2．孪生引物实时PCR基因分型技术。设计两种分别带不同荧光 标记的孪生引物，采用实时PCR同时检测野生型和突变型模板，首 次实现了非探针式单碱基突变的实时PCR基因分型。f该技术速度快， 易于自动化，特别适合大量单碱基突变基因的筛查。卜—～ 3．孪生引物实时PCR检测端粒酶活性。端粒酶催化生成的核酸 产物由许多短的重复序列组成，用一般的PCR方法检测容易形成引 物二聚体，由于引物二聚体与特异扩增产物的序列相同，无法用基 于探针或荧光染料的实时PCR特异检测。俄们利用标记型孪生引物 特有的特异扩增能力，实现了端粒酶活性的实时PCR检测。}， 4．用荧光淬灭双链探针研究核酸酶的活性。在孪生引物的基础 上设计出荧光淬灭双链探针，建立了研究DNase I酶切活性的实时 示踪方法。 另外，利用双激光荧光毛细管电泳技术研究了分子信标在实时 PCR中的作用机理。(据此提出了采用轻微不对称PcR扩增能获得更 高的检测灵敏度，并用实验加以证实≯一 关键词：实时PCR，基因分型，荧光淬灭双链探针，分子信标 ANew ofReal—TimeFluorescencePCRDetection Type AndIts System Applications Abstract Real-timePCRisa fornucleic technique acids newlydeveloped in hasbecome clinical detection，and important diagnostics． increasingly withconventionalPCRdetection PCR Compared methods，real—time combines anddetectioninone is tobe amplification step，andeasy because automation，PCRcontaminationisalso ofthe product