桃蚜和禾谷缢管蚜体内参与传毒的共生BuchneraspgroEL基因的克隆与原核表达.pdfVIP

砚 . . . . . . . . . ， . . . . . 摘 要 蚜虫是植物病毒传播的最重要的昆虫介体，由其传播的病毒病害造成多种农作 物、蔬菜及经济作物的严重损失。阐明墅奥竺参的分子机剑可望为蚜传病毒病的防 治找到新的思路。伽人从病毒方面己对大量的参与蚜虫传毒的分子决定物进行了鉴 定和功能分析，但对参与传毒的蚜虫介体因子报道很少。户 本实验室采用免疫沉淀法从桃蚜 (A为vzuspersicae)体内分离纯化了一种63ku 的病毒结合蛋白，本研究通过此蛋白部分氨基酸序列的分析，设计特异性引物，利 用PCR技术从桃蚜和禾谷绕管蚜 (Rhopalosiphumpadi)中克隆编码此蛋白的基因 、 并进行RLI}-*it研究。(I要结果如下。 (1)以桃蚜和禾谷绕管蚜杨凌生物型为材料，利用设计的特异性引物，采用PCR 的方法在国内首先从桃蚜体内扩增出此病毒结合蛋白基因，通过全长基因序列测定、 核昔酸同源性比较、氨基酸序列推导与比较，在核昔酸和氨基酸序列水平确认该蛋 白为蚜虫内共生菌((Buchnerasp.)卫ro互L矍皇。序列测定结果表明桃蚜杨凌生物型 BuchneragroEL基因(GeneBank登录号为AF367248)全长为1647by，其与荷兰生 物型BuchneragroEL基因 (AF003957)仅存在7个核昔酸的差异，同源性为99%, 氨基酸推导结果表明其编码548个氨基酸，在氨基酸水平两者存在 3个氨基酸的差 异。克隆的禾谷绕管蚜内共生菌BuchneragroEL基因 (GeneBank登录号为 AF387864)全长也为 1647by，与禾谷W管蚜美国生物型BuchneragroEL基因 (U77380)存在37个碱基的差异，同源性为97%，在氨基酸水平存在 14个氨基酸 的差异，其中在第182-185位变化较大，VFKD”突变为 “GLQN (2)将克隆的桃蚜和禾谷绕管蚜BuchneragroEL基因连接到原核表达载体 pBV221,pET30a和pTrcHisA上，构建了含2个目的基因的6个表达原核表达载体: pBVML,pBVPR,pETMLpETPR和pTroML,pTrcPR，转化大肠杆菌BL21(DE3)进 行表达研究。结果表明，载体pBVML和pBVPR在42C诱导2}4,6hr,SDS 检测2个载体均可表达出63ku的非融合蛋白，但表达量较低;pETML和pETPR融 合表达载体经IPTG诱导可启动桃蚜和禾谷绕管蚜BuchneragroEL基因的高水平表 达，表达的融合蛋白分子量为69ku，在诱导4hr时表达量最高;用pTrcHisA载体 未能表达出目的蛋白。方了’- 通过本研究在国内首先获得了桃蚜和杨凌生物型内共生菌Buchner} 让~基}] 并对其进行了初步的表达研究，为进一步研究GroEL蛋白在蚜虫传毒中的功能和基 因工程途径利用打下了基础。 关键词 桃蚜 内共生，砰uchneraGroE毋传匆r 月，，毛}，意 CloningandProkaryoticExpressionofgroELGenesof EndosymbioticBacteriumfrom均zuspersicaeand losiphunpadiYanglingBiotype Postgraduate:CuiXiaofeng