GUS基因在优化海带表达系统中的应用.pdfVIP

翻乡韵 cus刁‘因在优化海带农达系统 中的应用 中科 艳忆海 洋 诵斤不国d卜七仑文 摘 要 本文研究了如何应用GUS基因优化海带表达系统。首先研究了GUS在各种海带材料 中的本底值，而后以GUS基因作为报告基因比较了几种基因工程常用启动子在海带中启动 瞬间表达的效率。选择表达效率较高的真核藻类启动子与GUS基因融合，在海带中获得了 稳定表达的结果。 别用组织化学染色法和荧光分析法对海带雌配子体、雄配子体、孤雌生殖海带幼抱 二倍体海带抱子体等四种不同的材料的GUS本底进行了检测。组织染色的结果表 明，各种海带材料在无菌海水中培养一个月后都没能检测到GUS本底。荧光分析法所得数 据显示，这四种材料的GUS活性分别为3.410.3,5.2士。.8.14.4士士1.4(pmolMU mg-proteinmin-)，与高等植物类似，说明GUS基因可作为报告基因用于海带基因工程研 究。 选用真核藻启动子FCP启动子、藻类病毒的AMT启动子、高等植物基因T程中常用 的高效Ubi启动子和CaMV35S启动子，与GUS基因融合构建四种质粒，通过基因枪的方 法转化孤雌生殖海带幼抱子体，比较GUS基因在海带中的瞬间表达量。实验结果表明，与 CaMV35S和FCP融合的GUS基因在海带中表达效率较高。 采用基因枪的方法用FCP启动子一GUS基因转化海带雌配子体，通过诱导孤雌生殖获 得孤雌生殖海带幼抱子体，用组织染色法检测到了GUS活性，并从海带的总DNA中扩增 到了FCP启动子一GUS基因的特征条带，从而提示了FCP启动子能引导外源荃因在海带中 稳定表达。 为了找寻高效筛选元件进行了孤雌生殖海带对草丁麟的敏感性实验，用统计学的方法 得出了草丁麟对不同长度孤雌海带的半致死剂量。研究发现海带全长。.5-1.6cm范围内， 草丁麟的LDs。与海带长度不相关，同时发现浓度在2-5gg/ml狭小范围内的草丁麟对孤雌 海带比高浓度具有更为明显的毒性反应。本文结果提示草丁麟抗性荃因一bar基因有可能成 为海带基因工程更为理想的选择标记，因为海带对草丁麟比对抓霉素和潮霉素更敏感，而 后两者是目前采用的筛选压力. 本文结果为海带表达系统的优化，提供了有效的报告基因、启动子和选择标记元件。 二‘_一 .丫‘ _公尹_‘.少2 _._二、/ 夫健词 :海带一Ous基 囚 眉动寸 basta 表达 系统 - 拥.韵 Gus基 因在节七化海 帝衣达 系统 中的ZI用 中月牛碗七引卜到卜月斤i斑i创七Y仑-忆 Abstract WuYun(MarineBiology) DirectedbyProfQinSong TheapplicationofGUSgenetooptimizetheexpressionsystemofLaminariajaponicahas beenstudiedinthisthesis. Firstly,thebackgroundvaluesofGUSgeneproductwere investigatedinseveraltypesofkelpmaterials,thenGUSgenewasusedasareportergeneto comparethedrivingefficiencyoffourcommonusedpromotersrfomlandplantsoralgae.A highefficienteukaryoticalgaesourcepromoterwasselectedtodriveGUSgenetogetstable expression. BothhistochemicalandqualitativefluorometricGUSassayshavebeencarriedoutinfemale gametophytes,malegametophytes,youngparthenogeneticsporophytesanddiploidsporophytesof L.japonica.Theresultsshowedthatnobackgroundwasdetec