1433zeta蛋白多克隆抗体制备与鉴定.pdfVIP

摘要 14-3-3zeta亚型多克隆抗体的制备和鉴定 摘要 在。14—3-3蛋白是真核细胞中普遍存在的高度保守的蛋白家族，由7个亚型组 成。14-3-3zeta蛋白能够同时结合两个配体，是信号传导通路中的重要接头蛋 白。14-3-3zeta蛋白可以和受体、激酶等多种配体结合，通过相互作用调节它 们的生物学活性。14—3—3蛋白是一种重要的抑制凋亡因子，近年来的研究表明 14—3—3zeta与糖尿病肾病、抑郁症、老年性痴呆病等多种疾病有关，但其相关机 理仍未完全阐明。有关报道显示14-3—3zeta蛋白在乳腺癌、肝癌中过量表达， 可能成为肿瘤诊断中的一种新型潜在标记物 断提供有利的工具。14-3-3蛋白家族高度保守，各亚型之间的同源性超过7096。 目前所报道的14—3—3zeta抗体均未对14—3—3蛋白的7个亚型进行特异性鉴定， 无法说明它的特异性。本论文旨在制备抗14—3一zeta蛋白的特异性抗体。为此， 我们从以下几个方面进行了研究。 氨基酸序列的同源性、疏水性、抗原决定簇等进行分析。通过对分析的结果进行 序列为免疫肽段。该段多肽的特异性较大，亲水性较强，但免疫原性一般。为增 强该肽段的免疫原性，将其铰链在BSA上，获得合成抗原。 菌中诱导表达14—3—3zeta基因融合蛋白的表达，通过His一镍亲和基质纯化 步纯化和除盐。对含有目标蛋白的凝胶进行切割处理。冷冻干燥后碾成粉末，作 为重组蛋白抗原。 多肽以及14—3—3zeta重组蛋白作为抗原，对纯种新西兰兔进行免疫，获得了兔 摘要 抗血清进行效价测定。Western 为1：500，而兔抗14—3—3zeta多肽抗体的效价为l：400。 体、自制的兔抗zeta蛋白抗体及自制的兔抗zeta蛋白C端多肽抗体标记。实验 结果表明兔抗zeta蛋白C端多肽抗体具有特异性，仅识别zeta亚型；而兔抗zeta 蛋白抗体可以结合zeta,tau，ganlna三种亚型。 抗14-3-3zeta蛋白C端多肽抗体标记转染后的细胞，实验结果表明该抗体可以 以上研究结果初步证明：抗14—3—3zeta多肽抗体具有特异性，仅结合14—3—3 蛋白的功能进一步研究与肿瘤诊断提供了有利的工具。 [关键词]14-3-3zeta；免疫印迹法；多克隆抗体；生物信息学； 2 ．Abstract andIdentificationof antibodies Preparation polyclonal 14—3-3zetaisoform against Abstract 14—。3—。3zeta to conservedfami wasubi belonghigh which proteinly in mammaliancells．Therearesevenknownmammalian —quitouslyexpressed 14_3—3 by can zetaformdimmerwhichinteractwith seperategenes．14—3—3 avariety ofproteinsincludingprotein other kinase，receptor，