2010硕士研究生-PCR课程.pptVIP

③ 延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 循环次数 决定PCR扩增程度; 主要取决于模板DNA的浓度; 选在30～40次之间; 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 PCR反应特点 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 特异性强 关键：引物与模板的正确结合 引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的 合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高 PCR反应的特异性决定因素 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性 灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 ( pg=10-12 ) 量级的起始待测模板扩增到微克( ug=10-6)水平 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个RFU (空斑形成单位) 在细菌学中最小检出率为3个细菌 简便、快速 PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广 对标本的纯度要求低 不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测 * 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 概念 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR技术简史 PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 (简称 Taq polymerase), 则是于1976年从热泉 Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication)，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制 (类似PCR前两个周期反应) 的实验。 而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年，Science 将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子 (Molecule of the year)，而PCR本身则列为年度的重要科学