感染性疾病病原的诊断策略-上海交通大学医学院.ppt

感染性疾病病原的诊断策略 上海交通大学医学院病原生物学教研室 周与华 作者简介 周与华 2005年6月毕业于上海第二医科大学临床医学专业，现为上海交通大学医学院病原生物学教研室教师，承担本科生的病原生物学课程的教学工作。2009年9月入学为病原生物学专业博士研究生。 主要研究方向为：呼吸道病原菌的诊断鉴定和菌群研究。 学习目标 掌握：自动化鉴定技术、ELISA、核酸探针、PCR诊断、16s文库诊断技术的基本原理。 熟悉：ELISA实验的主要实验策略和应用侧重；基因芯片技术的原理。 了解：测序技术的初步应用。 病原诊断策略的分类 病原诊断策略 以表现型为基础的方法 以基因型为基础的方法 基于生物学性状和生化反应 基于免疫学特性 基于特异性基因的检出和扩增 基于测序 第一部分以表现型为基础的方法 一、基于生物学性状（物理学特性）和生化反应 基于生物学性状和生化反应的鉴定方法是微生物学发展过程中，通过对于不同微生物的观察，根据其形态学、染色性、与不同物质的生化反应总结出的一系列微生物学的经典方法。 生物学性状和生化反应 手工鉴定技术 自动化鉴定技术 手工鉴定 虽然检测效率远远低于其他技术，但是手动鉴定技术承载了众多微生物学研究的经典方法，在某些欠发达地区和紧急情况中，它依然有其不可替代的地位 平板划线分离培养，观察菌落特征 尿道脓性分泌物中，运用革兰染色检出淋病奈瑟菌 血平板培养，观察不同链球菌的溶血特征 自动化鉴定技术 自动化技术就是将经典的微生物试验系统化、标准化后，形成各种不同的反应谱，将检测的细菌反应结果与标准化的代谢谱比对，做出相应的鉴定结果； 自动化细菌鉴定仪就是其中的代表。 自动化细菌鉴定仪 自动化鉴定技术的系统反应 系统反应 分析物 阳性反应指示物 pH基础反应 碳源 pH指示剂颜色变化 酶谱 酶 适当的酶脱水致无色复合物释放染色质/荧光素引起颜色变化 碳源利用 有机产物 电子转化成无色的四唑基标记的碳源将染料变成粉色 挥发性或非挥发性酸检测 细胞性脂肪酸 终产物的呈色轨迹与已知谱比较 可见的生长检测 不同的基质 由于基质中病原体的生长导致的混浊 基于物理特性和生化反应方法的局限性 不同的细菌可能会出现相似的表现型，出现交叉反应。 培养的步骤往往不可缺少，延长了检测鉴定的时间。 由于可以体外培养的细菌数量有限，一些营养要求高、厌氧性细菌可能出现漏诊。 二、基于免疫学特征 病原体的免疫学检查并非直接从病人的体内检出病原体本身，而通过检测其在人体中释放的抗原或者由此激发人体产生的抗体，来间接寻找机体感染证据的策略。 免疫测定分为液相免疫测定(LPIA)和固相免疫测定(SPIA)，在病原体的诊断中主要依赖SPIA，其中以酶联免疫吸附试验(ELISA)最具代表性。 ELISA的原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。 此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。 因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 ELISA的原理 与底物作用显色 Ab 酶标板 Ag 结合的抗抗体 ELISA的主要策略 ELISA的主要策略 直接法（不常用） 间接法 双抗夹心法 检测病人体内的特异性抗体 检测病原体的抗原 ELISA间接法的实验过程 将病原体的抗原固定于固相载体表面，与含有抗体的病人血清反应 反应后洗脱未结合的抗体 加入酶标二抗 反应后洗脱未结合的二抗，加入酶反应底物 拥有特异性抗体的病人血清显色，颜色的深浅和抗体的浓度呈正相关 基于免疫特征的方法存在的优缺点 优点： 多数基于免疫学的方法为培养不依赖的方法，在检测无法体外培养的病原体存在明显的优势。 缺点： 已知的抗原或抗体有限，因此可检测的病原体有限。 交叉反应多见，容易出现假阳性。 如果需要确诊疾病，需要多次采样。 第二部分以基因型为基础的方法 概述 基于表现型的方法往往存在费时、高成本、可检测病原体局限等诸多问题； 而以基因型为基础的鉴定方法拥有高敏感性、节省时间，可测病原体范围广等诸多优势，因此成为了未来病原体检测鉴定技术的趋势。 以基因型为基础的方法 主要策略 基于病原体特异性基因的方法 基于测序的方法 核酸探针 基因芯片 聚合酶链反应(PCR) 基于细菌16s rDNA文库的诊断技术 基因组测序 基于病原体特异性基因的方法 不同的病原体在其各自的基因组中存在具有高度特异性的基因序列，这些序列可以通过核酸配对原则，运用经过标记的核酸探针与之杂交，经过相应的信号放大系统可以达到检测的目的，同时运用针对这些基因的特异