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6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 蛋白质组学研究技术 等点聚焦操作步骤 7. 分清胶条的正负极，轻轻地 将IPG胶条胶面朝下置于聚焦 盘或水化盘中样品溶液上，使 得胶条的正极（标有+）对应 于聚焦盘的正极。确保胶条与 电极紧密接触。不要使样品溶 液弄到胶条背面的塑料支撑膜 上，因为这些溶液不会被胶条 吸收。同样还要注意不使胶条 下面的溶液产生气泡。如果已 经产生气泡，用镊子轻轻地提 起胶条的一端，上下移动胶条 ，直到气泡被赶到胶条以外。 蛋白质组学研究技术 等点聚焦操作步骤 蛋白质组学研究技术 等点聚焦操作步骤 8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的 蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢 慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 等电聚焦程序 7cm胶条 水化 50V 12-16小时（20℃） 主动水化 S1 250V 线性 30分钟 除盐 S2 500V 快速 30分钟 除盐 S3 4000V 线性 3小时 升压 S4 4000V 快速 20,000伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 ?? 选择所放置的胶条数。 ?? 设置每根胶条的极限电流。（30-50μA/根）， 设置等电聚焦时的温度。（20℃） 11cm胶条 水化 50V 12-16小时（17℃） 主动水化 S1 250V 线性 30分钟 除盐 S2 1000V 快速 30分钟 除盐 S3 8000V 线性 4小时 升压 S4 8000V 快速 40,000伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 ?? 选择所放置的胶条数。 ?? 设置每根胶条的极限电流。（50μA/根） ?? 设置等电聚焦时的温度。（20℃） 17cm胶条 水化12小时（20℃）主动水化（50V）或被动水化 S1 250V 线性 30分钟 除盐 S2 1000V 快速 1小时 除盐 S3 10000V 线性 5小时 升压 S4 10000V 快速 60,000伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 ?? 选择所放置的胶条数。 ?? 设置每根胶条的极限电流。（50-70μA/根） ?? 设置等电聚焦时的温度。（20℃） 蛋白质组学研究技术 等点聚焦操作步骤 下面的表格给出了建议使用的IPG胶条运行的总volt-hours。这仅提供参考，不同的样品需要的volt-hours不同。当聚焦过程无法达到最高电压时，只要最后能达到总的volt-hours，且7cm胶条电压不低于3000伏，11cm胶条电压不低于5000伏，17cm胶条电压不低于7000伏，也能对样品进行充分的聚焦。 ReadyStrip IPG胶条的长度 最高电压 建议的Volt-Hours 7 cm 8,000V 8,000-10,000V-hr 11cm 8,000V 20,000-40,000V-hr 17cm 10,000V 30,000-60,000V-hr 蛋白质组学研究技术 等点聚焦操作步骤 试剂成分及用量 分离胶(10ml) 浓缩胶(10ml) 超纯水 3.3 6.8 30%丙烯酰胺 4.0 1.7 1.5mol/LTris-HClpH8.8 2.5 1.25 1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8 10%SDS 0.1 0.1 10% Ap 0.1 0.1 TEMED 4?l 10?l 1、分离胶及浓缩胶制备：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%，每块分离胶约40ml，浓缩胶约3-5ml，浓缩胶上部留1cm的空间，用25%乙醇封面，保持胶面平整。 蛋白质组学研究技术--第二向SDS操作步骤 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的乙醇，用干净滤纸吸干残留溶液。 3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟,使其溶解