第3章吸附层析45010.pptVIP

色谱常用术语 1．固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。 2．流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液)。在薄层层析时流动相又称展层剂。 3. 色谱 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。 5．床体积(Vt) 通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。 Vt是基质的外水体积(Vo)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和。即 Vt＝Vo十Vi十Vg 6．洗脱体积(Ve) 洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。 ? 7．外水体积(Vo) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和。 8．内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积。 9. 基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。Vo、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。? 图 层析床的外水体积(Vo)、内水体积(Vi)、总体积(Vt)示意图 10．分配系数和迁移率 分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值。常用K表示。 迁移率是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。 K值大，就表明该组分对固定相结合力大，迁移率小。反之则结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。 几种物质之间的分配系数或迁移率的差异程度是决定它们采用层析方法能否分离开的先决条件。其差异程度越大分离效果就越好。 色谱设备 色谱柱 梯度混合器 恒流泵 部分收集器 检测仪 记录仪 色谱操作 1. 色谱柱 2. 吸附剂及用量 3. 装柱 4. 上样和洗脱 5. 收集和检测 6. 吸附剂的再生 图 理想的装柱示意图 4. 上样和洗脱 图 加样操作示意图 5. 收集和检测 6. 吸附剂的再生 色谱分类 色谱图与色谱参数 色谱峰形状与峰宽 影响色谱峰大小的因素 色谱应用与局限 色谱分析的特点 色谱分析的局限性 第一节??? 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。 常用的吸附剂： 极性 羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性 活性炭等。 一、基本原理 吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点。这些位点通过范德华力和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合，其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。 图 吸附柱层析原理示意图 1.吸附层析柱 2.加入A、B混合样品 3.洗脱时，A与B开始分离 4.继续洗脱时，A与B已经分离 二、吸附剂 1．吸附剂的选择 吸附剂应具备性能： 表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等。 2. 吸附剂的性质 羟基磷灰石(HA) 硅胶 三、洗脱剂 合适的洗脱剂应符合下列条件： ①??? 纯度较高 ②??? 稳定性好 ③??? 能较完全洗脱下所分离的成分 ④??? 粘度小 ⑤??? 易和所需要的成分分开。 1. 纯化生命物质 图 天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HTP层析柱的分离图谱 2. 分离蛋白质的亚基 一般蛋白质经SDS或Triton X—100等去污剂处理后，会产生分子量不同的蛋白质亚基。这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离(见图)。 图 14C-组氨酸标记的免球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱 第二节 薄层层析Thin layer chromatography ,TLC 薄层层析(thin layer chromatography ,TLC)是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。 其基本原理和柱层祈、纸层折比较相近。 这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。 分类 吸附薄层层析(吸附剂为固定相) 分配薄层层析(固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为固定相) 离子交换薄层层析(离子交换剂为固定相)等 表 薄层层析常用的基质 与纸层析比薄层层析多一步薄层板的制作：